基于ACE2的抗SARS-CoV-2 S蛋白的单克隆中和抗体的筛选与研究

作     者：谭丽 

作者单位：河北北方学院 

学位级别：硕士

导师姓名：邹最;夏登云

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：SARS-CoV-2 COVID-19 单克隆抗体 杂交瘤融合 ELISA 亲和力 

摘      要：由刺突(S)蛋白与人体细胞表面血管紧张素转换酶2(AngiotensinConverting Enzyme 2,ACE2)受体结合所介导的严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-Co V-2)感染,被称为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)。SARS-CoV-2的广泛传播,以及缺乏特异性治疗药物,造成了上百万的患者死亡,对人类的健康以及公共卫生安全造成了巨大威胁。故临床上急需一种可以特异性靶向治疗COVID-19的药物。基于SARS-CoV-2感染宿主细胞依赖于S蛋白与ACE2结合,本课题拟研制以S蛋白的受体结合域(Receptor Binding Domain,RBD)为特定抗原表位的高亲和力抗体,并对抗体性能进行评价。取SARS-Co V-2 RBD蛋白免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与人骨髓瘤细胞融合,并利用ELISA方法,以RBD为抗原筛选阳性杂交瘤细胞。最终获得16株能稳定分泌抗SARS-Co V-2抗体的单克隆细胞株。抽提单克隆细胞株的m RNA,经过反转录,PCR,DNA纯化、连接、转化,测序等方法获得单克隆抗体序列。并将其合成质粒、瞬时转染后,成功纯化获得4株纯度较高的单克隆抗体。我们进一步从亲和力、竞争结合位点、假病毒中和活性检测,热稳定性检测、药代动力学实验等方面重点鉴定了14E3HL、14F4HL的性能。结果显示14F4HL和14E3HL与RBD蛋白结合时,它们的半最大效应浓度(Concentration for 50%of maximal effect,EC50)分别为0.00253μg/m L,0.02683μg/m L、与阳性对照LY-Co V555,JS016的EC50 0.0245μg/m L,0.0263μg/m L相当。14F4HL和14E3HL与除delta突变株之外的所有RBD的突变株都有着高水平的亲和力,且能与ACE2竞争性结合RBD蛋白。14E3HL和LY-Co V555能与14F4HL竞争性结合RBD,考虑14E3HL与14F4HL以及14F4HL与LY-Co V555之间可能存在部分表位重叠。14F4HL和14E3HL的溶解温度(Melting Temperature,Tm)值均为59.750℃,低于LY-Co V555和JS016(Etesevimab),但都具有较高的热稳定性。14F4HL和14E3HL在体外能有效地中和野生型以及其他几种突变型的假病毒株,在小鼠体内药物消除半衰期(T/2)分为153.04h和114.64h,远远长于LY-Co V555的半衰期时间。14F4HL的药时曲线下的面积(Area Under Curve,AUC)0-192h,达到了阳性对照LY-Co V555的两倍。综上所述,在本研究中筛选所得的2株单克隆抗体,14F4HL和14E3HL与RBD具有较高的亲和力、能中和除delta株以外的所有突变株,有着较高的假病毒中和活性,药物代谢时间长,热稳定性好。可用于除delta突变株以外的突变株病毒感染的单一疗法或鸡尾酒疗法的候选治疗。两株单克隆抗体有较好的成药性,适合进一步人源化研究。