枯草芽孢杆菌hfq基因参与调控葡萄糖利用及抗胁迫能力的研究

作     者：董梦瑶 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：彭广能

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：枯草芽孢杆菌 Hfq 葡萄糖利用 抗胁迫能力 群体感应 

摘      要：非编码小RNA(small RNA,sRNA)是维持细菌内部稳定的重要参与者,RNA分子伴侣Hfq可以保护sRNA免于降解并促进sRNA与靶标mRNA间的碱基配对,它在细菌生理活动中发挥的功能也被广泛鉴定。但是在枯草芽孢杆菌中关于Hfq蛋白的相关研究较少且集中在转录组分析和深度测序方面,对细菌生长和应激能力等的影响尚未得到详细阐述。为了探究Hfq在枯草芽孢杆菌中的作用,本研究以枯草芽孢杆菌标准株(*** 168,BS),hfq缺失株(BSΔhfq),回补株(BSΔhfq-C)为试验对象,进行葡萄糖利用、抗胁迫能力及生物膜形成的检测等相关试验,进一步了解Hfq的功能和可能的调控机制。在本研究中,我们首先对BS,BSΔhfq和BSΔhfq-C三种菌株利用葡萄糖的能力以及参与基因的表达水平进行了检测。将各个菌株的初始OD调整一致,于相同的条件下培养并定时检测OD,绘制出三种菌株在LB培养基、氮源培养基NM、无机盐培养基ISM以及不同葡萄糖浓度的碳源基础培养基BCM中的生长曲线。然后使用试剂盒检测三种菌株在不同葡萄糖浓度的BCM中生长时对数期(6-10h)内葡萄糖的消耗量,qRT-PCR法检测三种菌株中与碳代谢抑制反应相关的ccpA基因的表达水平。试验结果显示hfq缺失株在LB培养基中出现了生长缺陷,OD最大值较标准株下降了23.70%,但在氮源培养基NM及无机盐培养基ISM中hfq缺失株的生长没有出现缺陷。在葡萄糖浓度分别为0、0.5%和1%的碳源基础培养基BCM中,标准株BS的生长情况一直优于缺失株BSΔhfq;2%的葡萄糖浓度下三种菌株的生长情况最佳。相比于0%,葡萄糖浓度为5%时会抑制标准株和回补株的生长,但没有抑制hfq缺失株的。并且当BCM的葡萄糖浓度为2%时三种菌株对数期(6-10h)内的葡萄糖消耗量均达到最高,5%时三种菌株的葡萄糖消耗量均出现显著下降。在0和0.5%的葡萄糖浓度下,缺失株ccpA基因的表达水平相较于BS无显著性差异。在1%、2%和5%的葡萄糖浓度下hfq缺失株ccpA基因的表达水平上调,分别为22.95%、47.40%和85.07%。其次,通过调整固体培养基的pH、过氧化氢及NaCl浓度,创造酸性、氧化和渗透压胁迫环境后,利用平板计数法计算三种菌株在各种胁迫环境中的存活率,菌液直接滴加法观察在各种胁迫环境下三种菌株的菌落形态,运动直径测量法检测三种菌株在各种胁迫环境中的运动能力。利用结晶紫染色法对菌株的生物膜进行定量,并对胞外聚合物EPS(生物膜的主要组成部分)进行提取和称量。通过显微镜下直接观察和碘液染色后观察法研究三种菌株的生物膜结构,qRT-PCR法检测三种菌株在形成生物膜过程中与群体感应系统相关基因的表达水平的变化。结果显示,当LB固体培养基的pH为5、4时,相比于标准株BS,缺失株BSΔhfq的单菌落个数明显减少,菌落生长更缓慢,运动直径显著下降;当LB固体培养基的过氧化氢浓度为0.5、1mmol/L时出现相似的现象。但在2.5%和5%NaCl的高渗透压胁迫环境下,hfq缺失株的单菌落个数多于标准株和回补株的,且生长速度更快、运动直径显著升高。而结晶紫染色法的结果证实hfq缺失株的生物膜形成量下降了62.65%,而胞外聚合物EPS的重量下降了41.69%。生物膜结构出现了边缘变薄,内部蜂窝结构间隙变大等情况。qRT-PCR结果显示,hfq的缺失造成群体感应系统相关基因ComQ、ComX、Rap B等的表达水平显著上调,ComA、ComK、ComS等的表达水平显著下调,参与生物膜形成的基因sigA、sigB、sigH、spo0A和spo0B的表达水平显著下调。本研究证实枯草芽孢杆菌hfq缺失造成的生长缺陷可以通过调整环境中的葡萄糖浓度来弥补,并且与ccpA介导的碳代谢抑制反应存在一定关联;Hfq的存在是枯草芽孢杆菌抵御酸性及氧化胁迫环境压力的关键,但在渗透压胁迫下是非必需的;Hfq在枯草芽孢杆菌的生物膜形成中发挥正向调控作用,且与群体感应系统有关。研究结果为Hfq在枯草芽孢杆菌中的作用和机制研究提供了依据,促进了Hfq作用的靶标sRNA或mRNA的寻找。