植物凝集素对肝癌细胞活性和迁移能力的影响及分子机制研究

作     者：蒋浩然 

作者单位：重庆邮电大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张冰玉

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：植物凝集素 人肝癌细胞 迁移 MAPK通路 细胞骨架 

摘      要：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种原发性肝癌,其糖基化过程经常出现异常。小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin,LCA)和刀豆凝集素(Canavalia A,Con A)是从天然植物中提取的蛋白,它们可与多种特定类型的单糖结合,在肿瘤治疗和检测中发挥重要作用。然而,它们在人类肝癌细胞迁移中的作用及分子机制仍不清楚。本课题将基于肝癌细胞的生物学特性,从分子/细胞水平考察LCA和Con A对体外培养的三种转移能力不同的肝癌细胞(HCCLM3、MHCC97L和Hep G2)与一种正常肝细胞(L02)活性与迁移能力的影响,并进一步考察LCA和Con A与人肝癌细胞相互作用的糖结合位点及其作用的分子机制。主要的实验方法和结果如下:1.LCA和Con A处理细胞后,用CCK-8法检测细胞活性,Transwell法检测细胞迁移能力。结果显示,LCA对四种细胞活性无明显影响,Con A能显著降低四种细胞的活性。此外,LCA和Con A均能特异性地抑制肝癌细胞(HCCLM3、MHCC97L和Hep G2)的迁移,而对正常肝细胞(L02)迁移无明显影响;2.通过蛋白质印迹(Western blot)检测LCA和Con A对HCCLM3 MAPK信号通路的影响,利用MAPK通路抑制剂研究MAPK通路在LCA和Con A抑制HCCLM3迁移中的作用。结果显示,LCA通过激活ERK1/2和JNK1/2/3信号通路抑制HCCLM3的迁移,Con A通过激活ERK1/2、JNK1/2/3和p38信号通路抑制HCCLM3的迁移。但是Con A并不通过ERK1/2、JNK1/2/3和p38信号通路抑制HCCLM3的活性;3.通过RT-PCR和明胶酶谱检测LCA和Con A对HCCLM3基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)基因表达水平和蛋白活性的影响,通过免疫荧光染色检测LCA和Con A对HCCLM3细胞骨架(F-actin)的影响。结果显示,LCA和Con A对HCCLM3 MMP-2和MMP-9的基因表达和蛋白活性均无明显影响。LCA和Con A均可以减少HCCLM3中F-actin的含量,Con A还能减小HCCLM3的延展面积,让细胞从纤维状转变为圆形。此外,LCA和Con A对HCCLM3 F-actin聚合程度或延展面积的影响都与MAPK信号通路相关;4.通过糖抑制实验确定LCA和Con A与肝癌细胞的糖结合位点。我们将甘露糖/岩藻糖或葡萄糖/甘露糖与LCA或Con A提前作用,结果显示,LCA通过结合甘露糖/岩藻糖相关糖位点抑制肝癌细胞的迁移,Con A通过结合葡萄糖相关糖位点抑制肝癌细胞的迁移。此外,Con A对HCCLM3活性的抑制与葡萄糖/甘露糖相关糖位点无关。综上所述,LCA可能通过甘露糖和岩藻糖介导的ERK1/2和JNK1/2/3信号通路减少F-actin的形成,从而抑制人肝癌细胞的迁移;Con A可能与葡萄糖相关位点结合,激活ERK1/2、JNK1/2/3和p38信号通路,进一步收缩细胞,降低F-actin的含量,从而抑制HCCLM3的迁移。这些研究结果将加深人们对人肝癌细胞迁移与相关糖蛋白或信号分子之间联系的认识,并为LCA和Con A作为潜在抓糖/抗癌药物提供新的理论支持和实验依据。