ADSCs对大鼠脑出血后基于自噬的神经保护作用及机制研究

作     者：范语彤 

作者单位：华北理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周洪霞

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：脂肪间充质干细胞 脑出血 自噬 AKT/mTOR信号通路 

摘      要：目的通过分离培养SD大鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs),对细胞形态、表型进行鉴定后移植治疗脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)大鼠,进而探讨ADSCs移植治疗ICH大鼠是否基于对自噬产生的影响而发挥神经保护作用及可能作用机制。方法1大鼠ADSCs的分离与培养:随机选取10只约6～8周龄健康SD大鼠,在无菌环境下分离腹股沟周围脂肪,体外培养ADSCs,并培养至第4代,应用流式细胞仪对ADSCs表面标志物进行测定。2分组及模型制备:将190只成年雄性健康SD大鼠随机分为三组:假手术组(Sham组);脑出血模型组(ICH组):采用自体尾动脉血于基底节区注射(注血量为55μL)的方法制备ICH模型;脑出血模型+脂肪间充质干细胞组(ADSCs组):ICH造模成功2h后,经立体定位仪将5μL含有1×10个ADSCs细胞悬液缓慢注入大鼠右侧纹状体。术后每组分为12h、1d、3d、5d、7d五个不同时间点亚组进行检测。3检测指标如下:(1)Zea-longa评分法对大鼠进行神经功能学评分;(2)HE染色观察术后基底节区的病理学变化和细胞存活状态;(3)免疫荧光检测受损脑组织内ADSCs表面标记物CD29的表达;(4)尼氏染色光学显微镜下观察脑组织基底节区神经元细胞尼氏小体的变化,并对未受损神经元进行计数;(5)干-湿重法检测脑组织水含量;(6)免疫组织化学染色检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3、AKT和m TOR磷酸化的阳性细胞表达情况;(7)蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测脑组织中1d、3d自噬相关蛋白Beclin1和LC3、AKT/m TOR信号通路相关蛋白表达量。结果1 ADSCs检测结果:流式细胞仪检测所培养的大鼠腹股沟部脂肪细胞中其黏附分子CD29、CD90呈阳性表达,CD45呈阴性表达。2 HE染色显微镜下观察到ADSCs在大鼠脑组织中的存活。免疫荧光检测到脑组织中ADSCs的表面标记物CD29有阳性表达。3与Sham组相比,ICH组大鼠神经学评分显著增高(P0.05),各个观察时间点出现行为学改变,如向左转圈、倾倒甚至瘫痪等神经功能障碍。与ICH组相比,ADSCs组大鼠Zea-longa评分明显降低(P0.05)。4解剖大鼠针眼周围脑组织后肉眼可见Sham组:呈现正常的脑组织。ICH组与ADSCs组:基底节周围有脑组织损伤,可见脑室内出现点、片状出血,ADSCs组比ICH组状况有明显提升。HE染色显微镜下观察,Sham组大鼠脑组织结构完整,未见病理学变化。ICH组脑组织可见基底节周围明显占位效应,大量红细胞,细胞间隙变大、水肿,炎细胞浸润及大量神经细胞变性坏死。ADSCs组较ICH组病理组织变化明显减轻。5尼氏染色显微镜下观察并对未受损神经元计数,与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织内神经元细胞结构破坏严重,细胞皱缩,核碎裂,体积缩小,尼氏小体明显丢失(P0.05)。与ICH组相比,ADSCs组大鼠脑组织内神经细胞尼氏小体明显增多(P0.05)。6脑组织水含量测定,与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织含水量12h即开始升高,至3d达高峰,随后降低,各时间点差异均具有统计学意义(P0.05);与ICH组相比,ADSCs移植后ICH大鼠各时间点脑组织水含量明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。7免疫组织化学结果显示,Sham组中LC3、Beclin1、p-AKT、p-m TOR各个时间点表达均没有显著变化;与Sham组相比,ICH组中LC3、Beclin1、p-AKT、p-m TOR从12h开始阳性细胞表达明显上升,3d达高峰,随后逐渐下降;与ICH组相比,ADSCs组各个时间点LC3、Beclin1的阳性细胞表达明显降低,而p-AKT、p-m TOR的阳性细胞表达明显增加。8免疫蛋白印迹检测大鼠1d、3d脑组织中蛋白结果显示,LC3结果显示出两条深浅不同的双条带LC3I和LC3II,p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR的比值代表AKT、m TOR两种蛋白质的磷酸化水平。与Sham组相比,ICH组LC3II/I、Beclin1、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR蛋白含量增加,差异均具有统计学意义(P0.05)。与ICH组相比,ADSCs组LC3II/I、Beclin1的蛋白表达量明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),而p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR的蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1 ICH大鼠脑组织基底节区神经元细胞存在自噬的激活,并随着自噬活性的增强脑组织继发性损伤加重。2 ADSCs移植后可通过抑制自噬活性,改善ICH大鼠神经功能症状,减轻其血肿周围脑组织损伤。3 ADSCs移植可能通过AKT/m TOR通路抑制自噬活性,从而减轻ICH大鼠继发性脑损伤程度,并促进其神经功能恢复的作用。图19幅;表3个;参106篇。