褪黑素1型受体（MT1）调节α-突触核蛋白自噬降解的机制研究

作     者：姜书敏 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘春风

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：帕金森病 褪黑素1型受体(MT1) α-突触核蛋白 自噬 

摘      要：目的:研究褪黑素1型受体(Melatonin receptor 1,MT1)对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)异常聚集的影响和自噬性降解的机制,从而阐明MT1蛋白在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)发病中的作用,并寻找可能的治疗靶点。材料与方法:以新生鼠原代皮层神经元、HEK-293T细胞、HEK-293T过表达α-syn-GFP(α-syn-GFP HEK-293T)稳转细胞株为实验对象。(1)培养野生型(WT)和敲除MT1编码基因Mtnr1a(Mtnr1a KO)新生鼠的原代皮层神经元,给予α-syn预制原纤维(Preformed fibrils,PFF)10天,免疫荧光检测WT和Mtnr1a KO原代神经元中α-syn第129位丝氨酸磷酸化(pS129-α-syn)的分布和表达。(2)构建MT1质粒并转染HEK-293T细胞,western blotting检测自噬相关蛋白P62和LC3的表达。(3)筛选MT1胞内端的自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)结合结构域(LC3-interacting region,LIR),构建末端带生物素标记的MT1-LIR序列以及LIR序列突变的短肽,通过ELISA方法检测LC3与LIR位点的结合能力。(4)构建MT1-LIR位点突变质粒,通过免疫共沉淀方法检测MT1以及MT1-LIR位点突变后与LC3的蛋白间相互作用,通过免疫荧光观察MT1与LC3在细胞中的共定位。(5)α-syn-GFP HEK-293T稳转细胞株中转染MT1质粒,利用免疫共沉淀检测MT1与α-syn的蛋白相互作用,免疫荧光观察MT1、LC3和α-syn三者的共定位,western blotting检测P62、LC3以及α-syn蛋白含量。(6)HEK-293T细胞中共表达MT1和α-syn,western blotting检测P62、LC3以及α-syn蛋白含量。结果:原代皮层神经元经PFF处理10天后,免疫荧光结果显示pS129-α-syn蛋白呈点状分布在神经元突触中,与WT相比,Mtnr1a KO神经元中形成的pS129-α-syn数量增加,提示MT1缺失可能促进α-syn聚集。MT1过表达后western blotting显示细胞内P62含量降低、LC3-Ⅱ含量升高。通过序列比对筛选出MT1蛋白氨基酸序列中存在4个LIR位点,ELISA结果显示LIR4(Y306RRI309)短肽与LC3的结合能力最强(1μM结合达到饱和),LIR3短肽次之(4μM结合达到饱和),包含LIR1&2序列的短肽与LC3结合能力较弱,LIR3或LIR4位点突变后,与LC3结合下降,提示LIR位点与LC3存在直接结合。免疫共沉淀表明MT1与LC3存在蛋白间相互作用,LIR3位点或LIR4位点突变导致MT1与LC3结合减少;免疫荧光显示MT1与LC3存在细胞内共定位。免疫共沉淀结果表明MT1与α-syn存在蛋白间相互作用;同时免疫荧光显示MT1、LC3以及α-syn三者在细胞内存在共定位。MT1的过表达能够诱导自噬流的激活促进α-syn降解。结论:MT1的缺失促使神经元中PFF诱导的pS129-α-syn表达增加,从而加剧α-syn的聚集。而过表达MT1可以通过LIR序列结合LC3诱导自噬流的激活,促进α-syn的降解。