功能性核酸探针介导沙门氏菌增敏传感测定

作     者：张鑫磊 

作者单位：合肥工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐建国;姚帮本

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：沙门氏菌 功能性核酸 适配体 荧光共振能量转移 荧光偏振 

摘      要：沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌,可引起肠炎和系统性疾病,严重危害人们的健康。在世界各国的细菌性食物中毒事件中,沙门氏菌造成的中毒病例常居首位,严重威胁着人畜的生命安全。传统的沙门氏菌检测方法操作复杂、检测时间长,无法满足快速检测的要求,对食品中的沙门氏菌进行准确、快速的分析检测可预防该致病菌引发的食源性疾病,因此实现对沙门氏菌的定性和定量检测具有重要的研究意义,可以大大降低人体摄入沙门氏菌的概率。本文基于功能性核酸探针建立了三种方法对沙门氏菌检测展开了研究:(1)基于近程和远程荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)功能化核酸探针的沙门氏菌检测方法的建立。本方法在传统适配体编码分子信标(Aptamer-encoded molecular beacon,AEMB)的基础上,成功构建了荧光猝灭黑洞探针(Fluorescence quenching collapsar probe,FQCP),并将其应用于沙门氏菌的检测。在结构上,FQCP由AEMB通过特定的链霉亲和素(Streptavidin,SAV)和生物素(Biotin)结合组装。这种简单结合的方式使得FQCP产生近、远程荧光共振能量转移效应,从而导致其固有背景荧光明显被抑制,远低于传统的AEMB。此外,由于FQCP的3’端被阻断,其生物稳定性得到了提高,并且由于FQCP探针具有四个结合位点增加了与沙门氏菌反应的可能性,FQCP对沙门氏菌的识别反应动力学明显改善。结果表明,基于FQCP传感平台极大的提高了沙门氏菌检测信噪比,并且可以在30 min内快速输出相关的目标探测信号。在最佳的实验条件下,检测范围为2×103～2×109 CFU/mL,线性方程为 F519=580.67 lg[Csalmonella/(CFU/mL)]-1882.09,相关系数 R2=0.9918,检测限(Limitofdetection,LOD)为1.31×103 CFU/mL。回收率检测实验证明了此方法可以在水、牛奶、红牛、绿茶、橙汁和可口可乐中检测沙门氏菌。(2)多价适配体核酸探针结合触发式等温循环扩增(Trigging isothermal circular amplification,TICA)的沙门氏菌超灵敏检测方法的建立。在本方法中,开发了一种基于多价适配体探针(Multivalent aptamer probe,Multi-VAP)的TICA来快速和超灵敏地检测沙门氏菌。在该传感系统中,Multi-VAP的荧光通过双重FRET效应被强烈的猝灭。当体系中存在沙门氏菌时,目标物沙门氏菌会使Multi-VAP的构型配置发生改变,传感检测系统会出现触发式等温循环扩增将Multi-VAP的荧光调整至完全恢复状态。这种突出的特点使得强背景约束和强目标信号放大合理地结合在一个传感系统中,有利于提高检测信噪比,保证系统具有超高的灵敏度。适配体的使用确保系统具有良好的特异性。从添加样品到结果分析在30 min内即可完成。在最佳的实验条件下,检测范围为1×101～1×107CFU/mL,线性方程为 F=254.021g[CSalmonella/(CFU/mL)]-149.30,相关系数R2=0.9923,检测限为9 CFU/mL。该方法简化了操作流程,成功地应用于沙门氏菌特异性检测。(3)基于功能性核酸探针的荧光偏振法来检测沙门氏菌方法的建立。在本方法中,设计了一种带有沙门氏菌适配体的分子信标(Molecular beacon,MB)探针,结合DNA薄片后运用于沙门氏菌的荧光偏振法检测。在该传感系统中,偏振信号的增强是由于荧光信号探针(Fluorescent signal probe,FSP)结合DNA薄片后分子量增大和荧光基团的偏转角变小。传感系统依靠等温扩增实现了沙门氏菌的循环利用,目标物不断参与扩增,产生双链DNA分子和悬挂链,从而使得体系的偏振信号不断地恢复。整个沙门氏菌的检测在45 min内即可完成,在最佳的实验条件下,检测范围为1×101～1×107 CFU/mL,线性方程为F=29.58 1g[CSalmonella/(CFU/mL)]+22.80,相关系数 R2=0.9907,检测限为 7.2 CFU/mL。