L-谷氨酰胺对病原菌T3SS毒力基因表达及其对宿主粘附力的影响和相关机制探究

作     者：方鼎丽 

作者单位：厦门大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王岱

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：L-谷氨酰胺 三型分泌系统 病原菌 粘附 

摘      要：细菌为了更好地适应环境,完成运动、转运蛋白等复杂的生存任务,进化出了许多大分子装置,三型分泌系统(Type Ⅲ Secretion System,T3SS)就是其中之一。研究发现,许多病原菌都存在T3SS。其中,对于肠致病性大肠杆菌(Enteropathic Escherchia coli,EPEC)和肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)而言,T3SS是其在宿主细胞上形成粘附和抹平损伤(Attaching and effacing lesion,A/E lesion)的关键,A/E 损伤的形成是其成功感染的标志。对于丁香假单胞菌而言,T3SS则发挥了抑制植物宿主免疫功能、建立有利于细菌繁殖的水性质外体的作用。谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸,一般情况下,机体合成的谷氨酰胺能够满足人体的正常需求。但是在创伤、感染、手术等情况下,机体则需要额外补充大量谷氨酰胺。研究证实谷氨酰胺可维护肠道屏障功能,对某些病原菌的毒力也有抑制作用。在前期实验中我们发现,L-谷氨酰胺(L-glutamine,L-Gln)可影响EHEC菌株ZAP193三型分泌系统相关蛋白的分泌,基于这一发现,我们开展了以下探究。体外实验中,检测L-谷氨酰胺对EHECO157菌株ZAP193生长曲线、蛋白分泌的影响,提取细菌RNA进行转录组测序,通过荧光报告系统进行验证。结果表明L-谷氨酰胺可改变EHEC菌株ZAP193的增殖、T3SS相关蛋白的表达和分泌。随后,通过细胞实验进一步证明L-谷氨酰胺可影响ZAP 193在HeLa细胞上的粘附。体内实验中,选用六周龄BALB/c雌鼠建立EHEC O157感染模型,再对小鼠进行L-谷氨酰胺干预,结果表明L-谷氨酰胺可影响EHEC菌株EDL933在小鼠肠道中的粘附。为强化实验结果的说服力,选用LPS应答缺陷型小鼠C57BL/10ScNJ和天然致病株鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)进行实验,结果表明添加L-谷氨酰胺能影响感染后小鼠的生命体征及其死亡率。为了进一步探究L-谷氨酰胺在其他T3SS相关病原菌中是否也能发挥同样的作用,我们在植物病原体丁香假单胞菌番茄致病株(*** *** DC3000,简称Pst DC3000)中进行实验。结果表明,L-谷氨酰胺对pst DC3000的T3SS相关基因同样有类似作用。本研究通过一系列体内、体外实验表型证明了 L-谷氨酰胺对病原菌T3SS毒力基因表达及其对宿主粘附力的影响,并初步探讨了其中可能涉及的相关机制,可为L-谷氨酰胺在临床药物领域和农作物防治领域的应用提供新的理论支持。