杏鲍菇中CRISPR-Cas9基因编辑体系的构建

作     者：岳尚 

作者单位：南京师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陆玲

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：杏鲍菇 SdhB CRISPR-Cas9技术 pyrG 基因组定点编辑 

摘      要：杏鲍菇(Pleurotus eryngii)是侧耳属的一种重要的珍稀食用菌,具有很高的食用、药用、经济和生态学价值。杏鲍菇具有促进肠胃消化、增强人体免疫力、降血脂、降胆固醇、防止心血管疾病的功效,因此越来越受到消费者的青睐,以至于杏鲍菇的需求量逐年增高。然而,由于目前以杏鲍菇为对象的分子生物学层面的基础研究相对薄弱,在优良品种选育和生物技术应用中缺乏一种可靠的分子生物学工具。食用菌因其遗传规律复杂、营养体以双倍体作为存在形式,这些导致其基因敲除以及基因干扰效率低下,从而使得成功完成基因编辑的难度较大,故其分子遗传学研究技术水平远不能满足食用菌行业迅猛发展的需要。目前杏鲍菇等多种食用菌已经完成基因组测序,新一代CRISPR-Cas9基因编辑技术凭借成本低、打靶识别精度高、操作方便等优势已经成功地应用到动植物和其他种类的粮食作物的基因编辑中,这为食用菌分子遗传学研究提供了重要的理论和技术支持。本研究目的在于构建稳定且高效的杏鲍菇遗传转化体系和CRISPR-Cas9基因编辑体系,研究结果归纳如下:1.用PEG-Ca Cl介导原生质体转化的方法将构建的杏鲍菇Pgpd启动子和潮霉素hph抗性基因的质粒p EASY-Blunt-Pgpd-hph-trp C转化到杏鲍菇原生质体中,获得了具有抗潮霉素能力的转化子,成功地构建了以潮霉素抗性基因hph作为抗性筛选标记的遗传转化体系。2.同样,用PEG-Ca Cl介导原生质体转化的方法构建遗传转化体系。先克隆杏鲍菇sdh B(琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基)的全长序列(包括启动子和终止子);然后通过平菇、灰盖鬼伞和杏鲍菇Sdh B蛋白比对分析寻找到了萎锈灵结合的第239位的组氨酸保守位点;最终,将组氨酸定点突变为亮氨酸,成功获取了用于杏鲍菇遗传转化的筛选标记基因cbx。采用杏鲍菇筛选标记抗性基因cbx使杏鲍菇转化子菌株对萎锈灵产生了抗性,Southern blot的结果表明转化的基因cbx为单一拷贝,且稳定整合到了杏鲍菇的基因组上。3.根据杏鲍菇基因组密码子的使用偏好性,对CRISPR-Cas9系统的核心组分cas9基因的密码子进行了优化,成功检测到优化后Cas9蛋白的表达及核定位。同时在杏鲍菇基因组中对驱动sg RNA转录的Pol III RNA聚合酶类的启动子进巧挖掘,成功筛选出4个有功能的杏鲍菇U6 sn RNA启动子PEU6-1、PEU6-2、PEU6-3、PEU6-4,并在后续的原生质体转化试验中验证了其转录sg RNA的活性强于体外T7启动子的转录效率。4.以pyr G基因作为示例对优化的CRISPR-Cas9系统介导产生的遗传突变的类型以及遗传特点进行分析。研究表明CRISPR-Cas9系统介导产生的遗传变异包含非同源末端修复(NHEJ)的插入和缺失,同时包含同源末端修复(HR)的GFP片段的替换。遗传变异也能够稳定地遗传给下一代,并且整合到杏鲍菇细胞内的CRISPR-Cas9系统能继续对修饰的靶点基因进行编辑。以成功筛选获得的丧失乳清苷-5’-磷酸脱羧酶功能的杏鲍菇尿嘧啶营养缺陷型菌株作为背景菌株,用7个碱基同义点突变的pyr G基因回补尿嘧啶营养缺陷株Δpyr G,能够使其恢复正常生长表型,证明在以尿嘧啶营养缺陷株Δpyr G作为背景菌株时,同义点突变的pyr G可以作为营养缺陷型的筛选标记来构建遗传体系。本研究阐述了在食用菌杏鲍菇中构建了遗传转化体系以及构建了CRISPR-Cas9基因编辑系统。本文的基因编辑技术不但可以应用推广到除杏鲍菇以外的其它蘑菇品种,而且在蘑菇品种改良、代谢途径调控、功能生物学推进以及分子遗传学研究中得以广泛应用。