泛素连接酶MuRF2修饰PPAR γ1位点的初步研究

作     者：范玉成 

作者单位：宁夏医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：景丽

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：泛素化 泛素化位点 PPARγ1 MuRF2 DCM 

摘      要：目的初步研究泛素连接酶肌肉环指状蛋白2（Muscle ring finger protein2,MuRF2）泛素化修饰过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型1（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoform 1,PPARγ1）的位点。方法利用文献中报到的泛素位点预测软件UbiProber和UbiqSite对PPARγ1的泛素化位点（赖氨酸）进行预测;将获得支持向量机（Support Vector Machine,SVM）评分较高的位点进行点突变:赖氨酸（K）突变为精氨酸（R）,并构建PPARγ1野生型及位点突变型的过表达质粒,同时构建泛素（Ubiquitin,UBC）和MuRF2过表达质粒;将构建成功的PPARγ1野生型及位点突变型过表达质粒转染HEK 293T细胞,提取并纯化蛋白;以PPARγ1野生型及位点突变型纯化蛋白为基质,MuRF2为泛素连接酶构建体外泛素化反应体系,初步明确MuRF2泛素化修饰PPARγ1的位点;分别于HEK 293T细胞共转染MuRF2、UBC和PPARγ1野生型过表达质粒及MuRF2、UBC和PPARγ1位点突变型的过表达质粒,构建体内泛素化反应体系;通过半衰期实验比较PPARγ1野生型和位点突变型蛋白的半衰期,对泛素化实验获得的位点进行验证;通过RT-qPCR实验比较PPARγ1野生型和位点突变型对下游因子表达影响,进一步验证。结果（1）通过UbiProber（SVM0.8）和UbiqSite（SVM0.9）软件预测和SVM评分筛选,PPARγ1泛素化位点有:K68、K222、K228、K242和K356;将上述赖氨酸（K）突变为精氨酸（R）,经过DNA测序,成功构建PPARγ1 WT、PPARγ1 K68R、PPARγ1 K222R、PPARγ1 K228R、PPARγ1 K242R、PPARγ1 K356R和MuRF2、UBC过表达质粒。（2）WT、K68R、K222R、K228R、K242R、K356R过表达质粒成功转染HEK 293T细胞并获得纯化蛋白;以MuRF2为泛素连接酶构建的体外泛素化反应体系结果表明,较之于WT、K68R、K228R和K356R,K222R和K242R泛素化水平明显降低。（3）于HEK 293T细胞成功共转染MuRF2、UBC和WT过表达质粒及MuRF2、UBC和各位点突变型过表达质粒构建体内泛素化反应体系,结果表明,较之于WT、K68R、K228R、K242R和K356R,K222R泛素化水平明显降低。（4）半衰期实验显示,较之于WT,K222R蛋白泛素化水平明显降低,具有更长的半衰期。（5）RT-qPCR实验结果显示,较之于WT,K222R对下游因子PLIN2和CPT1B的表达产生显著影响,PLIN2和CPT1B的mRNA显著增加（P0.05）。结论通过构建泛素化反应体系,经过半衰期实验和RT-qPCR实验验证,我们初步研究发现K222是MuRF2泛素化修饰PPARγ1的位点。