基于等温扩增技术的超灵敏检测17β-雌二醇（E2）的荧光传感技术研究

作     者：王伟亚 

作者单位：滨州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：高志贤;王玖;白家磊;彭媛

授予年度：2021年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 100403[医学-营养与食品卫生学] 10[医学] 

主      题：核酸适配体 分子信标(MB) 等温扩增技术 

摘      要：目的:为了保证公共卫生健康和食品安全,亟待建立灵敏特异的检测方法进行乳制品和饮用水中E2（17β-estradiol,E2）污染的检测。本研究将核酸适配体、分子信标（Molecular Beacon,MB）和等温扩增技术结合,建立了基于等温扩增信号放大的E2超灵敏检测方法。方法:1.基于滚环扩增（Rolling Circle Amplification,RCA）技术高灵敏检测E2的荧光传感技术研究:本研究基于E2适配体（E2 Aptamer,Apt）,E2适配体的互补 DNA（complementary DNA of E2 Aptamer,cDNA）特有碱基的序列,以及E2、cDNA与Apt三者亲和力的差异,进行高灵敏检测E2的荧光传感技术研究。根据cDNA设计了多个挂锁探针（Padlock probe,P）和引物探针（Primer probe,p）序列,用于合成环 DNA（Circular DNA,circ-DNA）。Apt 与 cDNA特异性结合合成复合DNA（Compound DNA,com-DNA）。当有E2存在时,E2能解旋com-DNA游离cDNA和Apt,游离的cDNA与circ-DNA结合引发RCA扩增。RCA生成的长单链DNA（L-ssDNA）能解旋MB颈环结构,恢复其自然状态下猝灭的荧光,在波长为498 nm的激发光下,发出波长为525 nm的荧光,且E2浓度与荧光强度相关,从而实现了牛奶和水中E2的荧光检测。2.基于多步等温扩增的指数级信号放大E2超灵敏荧光检测技术:该策略将多种等温扩增方法串联:链置换反应（Strand Displacement Amplification,SDA）、RCA 及多引物滚环扩增（Multi-primer Rolling Circle Amplification,MRCA）。由于亲和力的差异E2能够解旋修饰在M270磁珠上的com-DNA,游离cDNA。cDNA与模板DNA（Template DNA,t-DNA）结合,启动SDA反应,生成大量与circ-DNA杂交结合的短单链DNA（ssDNA）引发RCA。RCA生成的长单链DNA（L-ssDNA）在酶作用下生成三条引物启动MRCA扩增,生成可与MB杂交的DNA链,打开MB的颈环结构,输出荧光信号。且E2浓度与荧光强度相关,从而实现了牛奶和水中E2的荧光检测。没有E2存在时,不能游离cDNA,无扩增,无产物,无信号输出。结果:1.基于RCA技术的高灵敏检测E2的荧光传感技术研究:经过条件优化,在0.001 ng/mL-10 ng/mL的浓度范围内E2浓度的对数（log C）与荧光强度呈现良好的线性关系。线性方程为:y=594.17x+3868.87（R2=0.9758）,检测限为0.698 pM。用该方法对E2的结构及功能类似物进行检测,均不产生荧光信号。牛奶和自来水中的加标回收率分别为81.33%-117.42%和81.79%-112.20%,相对标准偏差是1.09%-3.13%。2.基于多步等温扩增的指数级信号放大E2超灵敏荧光检测技术:在优化好的条件下,E2浓度的对数（log C）与荧光强度在0.001836 nM-183.6 nM范围内具有良好的线性关系。线性方程为y=856.16x+4586.62（R2=0.9856）,检测限为63.09 fM。用该方法对E2的结构及功能类似物进行检测,均不产生荧光信号。该方法对牛奶和水样的回收率分别为80.8%-96.7%和 89.2%-107.0%。相对标准偏差是 2.03%-6.41%。结论:1.本研究将适配体技术、等温扩增技术和MB结合,成功构建了两种用于乳制品和饮用水中E2检测的荧光生物传感技术。2.两种方案的方法均能实现乳制品和饮用水中微量E2的检测,且具有检测限低、特异性好、实验仪器要求低和更能满足现场检测的要求等特点。