超生理剂量雄激素通过PI3K/AKT/AR信号通路抑制前列腺癌MDVR、C4-2B细胞增殖的机制探讨

作     者：王振位 

作者单位：宁夏医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵瑞宁;聂黎虹

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：去势抵抗性前列腺癌 双氢睾酮 雄激素受体 信号通路 凋亡 

摘      要：目的雄激素一直被认为是促进前列腺癌(Prostate cancer,PCa)增殖的主要原因。目前有研究发现,雄激素对PCa可呈双相反应,超生理剂量雄激素可抑制激素敏感性PCa的增殖;但其是否可抑制激素非依赖性PCa尚未明确。本研究以去势抵抗性PCa(Castration resistant prostate cancer,CRPC)为研究背景,选取恩杂鲁胺耐药MDVR细胞及激素不敏感C4-2B细胞为细胞模型探究超生理剂量雄激素抑制MDVR、C4-2B细胞的作用及机制,期望为CRPC的治疗提供新的思路与方法。方法无菌条件下培养MDVR、C4-2B细胞。***8法、平板克隆形成实验检测MDVR、C4-2B对恩杂鲁胺(MDV3100)敏感性的差异。2.不同浓度DHT(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 ng·m L)干预MDVR、C4-2B细胞,细胞计数法、CCK8法筛选最佳给药浓度及给药时间点。***(0、1、2 ng·m L)干预MDVR、C4-2B细胞3 d,倒置显微镜下观察细胞形态变化,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,Hoechst33258染色检测细胞核形态变化,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡,Western bolt检测周期相关蛋白(Cyclin D1、CDK4、P21)、凋亡相关蛋白(BAX、Bcl2、Caspase3、Cleaved-caspase3)、PI3K/AKT通路蛋白(p-PI3K、p-AKT)、AR相关蛋白(AR、AR-V7、PSA)的变化。4.给予PI3K抑制剂沃曼青霉素(Wortmannin,WM,3μmol·L)、激动剂(740Y-P,20μmol·L)干预MDVR、C4-2B细胞,Western blot再次检测PI3K/AKT通路蛋白、凋亡蛋白、AR相关蛋白的变化。5.小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)沉默MDVR、C4-2B细胞AR表达后,Western blot检测AR相关蛋白、凋亡相关蛋白的变化。结果***、C4-2B细胞从形态上无明显差异,MDV 3100可显著抑制C4-2B的细胞存活率及克隆形成率(P0.05)。***8结果提示,不同浓度DHT(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 ng·m L)均可抑制MDVR、C4-2B细胞的存活率,对于MDVR细胞仅在0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 ng·m L DHT组内呈现出浓度依赖性下降(P0.05)。***(1、2 ng·m L)处理MDVR、C4-2B细胞后,与Ctrl组相比,细胞贴壁性能减弱,易脱落,细胞数量减少,并且细胞形态也发生改变,呈不规则串珠样改变,细胞周围可见散落的细胞碎片;同时,与Ctrl组比较,DHT组(1、2 ng·m L)抑制MDVR、C4-2B细胞克隆的形成,减少克隆形成率(P0.05),减弱细胞的迁移能力(P0.05)。4.与Ctrl组相比,DHT(1、2 ng·m L)可诱导MDVR、C4-2B细胞G0/G1期阻滞,降低S期细胞比例,下调Cyclin D1、CDK4蛋白表达(P0.05),上调P21蛋白表达(P0.05)。***(1、2 ng·m L)处理MDVR、C4-2B细胞,与Ctrl组对比,Hoechst33258核染后两种细胞不同程度地出现核固缩、核碎裂、细胞破裂等凋亡征象;Annexin V/PI染色后流式细胞术检测进一步证实细胞发生了凋亡(P0.01);与Ctrl组比较,DHT组(1、2 ng·m L)BAX、Caspase3、Cleaved-caspase3蛋白上调(P0.05),Bcl2蛋白下调(P0.05),BAX/Bcl2比值增加。6.与Ctrl组比较,DHT(1 ng·m L)、Wortmannin均可下调MDVR、C4-2B细胞p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7、PSA、Bcl2蛋白表达(P0.05),上调BAX、Caspase3、Cleaved-caspase3蛋白表达(P0.05);联合应用DHT、740Y-P,与DHT组比较,