利用Dual RNA-seq技术挖掘大花惠兰菌根共生相关基因

作     者：张居生 

作者单位：华南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵小兰

授予年度：2020年

学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学] 

主      题：大花蕙兰 菌根共生 Dual RNA-seq 效应蛋白 

摘      要：兰科植物是植物界三大科之一,而大多数兰科植物具有很高的观赏、药用和科研价值。目前,一些重要的观赏兰科植物已实现组织培养育苗,但组培苗出瓶后生长缓慢导致其生产成本过高。在自然条件下,菌根真菌的共生对于兰科植物种子萌发和原球茎生长是必须的,这种互作关系被认为是兰花寄生于真菌。但是否可以利用菌根真菌促进兰花组培幼苗生长?已经具备光合作用能力的兰苗与菌根真菌之间是否呈现特殊的互作机制?本论文以大花蕙兰菌--根共生为研究对象,对比研究宿主与两种不同类型菌根真菌在互作不同阶段的基因响应,并分析菌根真菌效应因子在菌根形成中的应答。本论文主要研究结果如下:(1)瘤菌根菌ML01和印度梨形孢DSM11827均可以在密闭的土壤基质中与大花蕙兰幼苗形成菌根,但两者的定殖进程和生长效应有差异。印度梨形孢比ML01侵染速度更快,但是共培养7 d后,ML01的定殖率大于印度梨形孢,在第14天时侵染率达到了最大,在第21天时有菌丝团降解现象。两种真菌对大花蕙兰茎叶中的N、P、K、Ca、Mg、Zn的吸收有促进作用,对根系中的N、P、K、Ca、Zn、Cu的吸收有促进作用,为兰花的生长发育提供矿质营养。(2)对真菌ML01进行全基因组测序,经过组装后真菌ML01的基因组大小为81.39 Mb,获得了51个contigs,N50长度为3.20 Mb,基因预测后共得到19733个基因编码蛋白,CDS注释率为90%以上。通过生物信息学预测得到了887个分泌蛋白和391个效应蛋白,其中PCWDEs有135个,质外体效应蛋白有187个,细胞内效应蛋白有69个。(3)利用转录组数据对大花蕙兰菌根转录本进行优化组装,用软件megan和真菌基因组去除菌根转录本中的非兰花序列。组装结果得到了108012条转录本,序列总长为143.12 Mb,N50为1732 bp,预测的CDS有55559条,平均长度为1389.4bp,用BUSCO检测完整度为85.2%,NR注释率为52.56%,Swiss-Prot注释率为38.34%,GO注释率为37.97%。通过氨基酸同源比对分析(Identity50%)和保守域预测,获得与已知植物共生功能基因盒序列高度相似的大花蕙兰序列94条。(4)RNA-seq分析结果显示,ML01处理的兰花差异表达基因有17503个,印度梨形孢处理的兰花差异表达基因有12298个。WGCNA得到的模块和不同时间点的DEGs进行GO和KEGG富集分析发现主要在淀粉和蔗糖代谢、类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成的通路中得到富集;分析同源的兰花共生相关基因发现OM共生与SLs酯酶、ABC转运蛋白、磷酸盐转运蛋白、铵盐转运蛋白、细胞色素P450基因相关。对比研究宿主与两种不同类型菌根真菌在互作不同阶段的基因响应,研究发现兰科菌根真菌ML01处理形成的菌根要比内生真菌印度梨形孢形成的菌根的亲和力高,更能说明ML01比印度梨形孢更能促进兰花的生长。(5)对真菌差异基因进行分析,ML01处理的不同时间点真菌DEGs分别为4787、4481和4797个,印度梨形孢处理的不同时间点真菌DEGs分别为3445,3882和3991个。经过富集分析主要在纤维素分解代谢、脂肪酸生物合成中得到了富集;分析了纤维素降解相关基因的表达模式,它们两种不同类型的真菌入侵进程不同。本研究利用转录组、真菌基因组解决了菌根从头组装过程中真菌序列除去的问题,为研究OM菌根共生机理提供可靠的转录本。得到了OM真菌基因组,为研究OM菌根共生中真菌的效应蛋白的筛选提供基础。初步分析了菌根中真菌和兰花在共生过程中的部分基因和通路上的变化。本研究为我们初步了解OM菌根共生机理提供新见解,为瓶内幼苗快速生长提供新方法。