苯硼酸功能化磁珠在金黄色葡萄球菌检测中应用的研究及苯硼酸磁分离试剂盒的开发

作     者：王峥峥 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许恒毅;吴鑫

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：3-氨基苯硼酸 聚乙二醇 磁分离 猪免疫球蛋白G 金黄色葡萄球菌 

摘      要：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性细菌,经常污染蔬菜、肉类等食品,严重威胁人们的生命健康。因此,建立准确有效的检测方法对于监控和预防***引起的食品安全问题具有重要意义。但复杂的食物基质会严重影响检测方法的灵敏度和准确度,而将磁分离(Magnetic separation,MS)等前处理技术应用于样本的前处理过程中,可以有效消除基质对检测方法的干扰。在致病菌磁分离时,常用识别致病菌的分子主要包括抗体、适配体、抗生素、含硼酸根的分子等。其中硼酸盐衍生物3-氨基苯硼酸盐酸盐(3-Aminophenyl boronic acid hydrochloride,APBA),可以通过可逆酯化作用与细菌表面的邻二羟基基团结合,相较于抗体或抗生素等识别分子,APBA具有相似的与致病菌结合能力、稳定、易于制备、价格低廉等优点。本研究以APBA作为识别分子,并通过“直接和“间接偶联的方式制备功能化磁珠(Magnetic beads,MBs),对加标样本中的***分离富集,并结合比色法(MS-比色法)和荧光法(MS-荧光法)对***进行灵敏、准确检测。各章节的内容如下:第一章综述了用于MS技术的识别分子种类、偶联方式以及APBA在食源性致病菌检测中应用的研究进展。第二章:为了实现对样本中***的分离及检测,研究建立基于MBs-APBA结合比色法检测***的方法。通过“直接偶联方式制备用于分离富集***的MBs-APBA,进一步联合辣根过氧化物酶标记的猪免疫球蛋白G(Horseradish peroxidase-pig immunoglobin G,HRP-pig Ig G),形成“三明治结构复合物(HRP-pig Ig G@***@APBA-MBs),催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)发生显色反应,并优化HRP-pig Ig G用量及孵育时间,实现对***的比色检测。在最优条件下,对PBS中***的捕获效率(Capture efficiency,CE)大于95.3%,APBA-MBs对菠菜、果汁和池水加标样中***的CE分别大于92%、90.5%和94%。MS-比色法在果汁、池水和菠菜中的检测限(Limit of detection,LOD)均为3.0×10CFU/m L。本研究制备的MBs-APBA对***具有分离、富集能力,联合比色法可以对***进行灵敏检测。第三章:为了降低对样本中***富集、分离的成本,并进一步缩短检测时间,研究建立基于MBs-PEG-APBA结合荧光法检测***的方法。通过“间接偶联方式,将PEG作为介导物,制备用于分离富集***的MBs-PEG-APBA,进一步联合异硫氰酸荧光素标记的猪免疫球蛋白G(Fluorescein Isothiocyanate-pig immunoglobin G,FITC-pig Ig G),形成“三明治结构复合物(FITC-pig Ig G@***@APBA-PEG-MBs),并优化FITC-pig Ig G用量及孵育时间,实现对***的荧光检测。在最优条件下,APBA-PEG-MBs对PBS中***的CE大于94.2%,对菠菜、果汁和池水加标样中***的CE分别大于92.6%、91.6%和91.6%。MS-荧光法在菠菜、果汁和池水加标样中对***的LOD均为2.7×10 CFU/m L。此外,与MS-比色法相比,本研究有效减少了MBs的用量(约30%)和缩短了检测时间(约20 min)。本研究制备的MBs-APBA具有对***低成本分离、富集能力,联合荧光法可以对***进行灵敏、快速检测。第四章:为了方便将APBA磁分离方法用于实际检测中***的富集分离,本研究组装苯硼酸磁分离试剂盒。通过评价试剂盒富集分离不同样本中***的性能以及重复性、稳定性以及储存时间等指标,组装了苯硼酸磁分离试剂盒。在最佳条件下,批内、批间的试剂盒对***的CE均为90%,在保存175天后,对加标样中***具有93%的CE。本研究开发的试剂盒具有较好的稳定性、重复性,可以分离富集不同样本中的***。综上所述,本研究制备的APBA磁性纳米材料对食品样本中的***具有较好的富集分离效率,并结合比色和荧光法可以实现对***的灵敏、快速检测。在进一步的研究中,开发的APBA磁