蓖麻茎色相关基因RcGST-F11表达纯化、晶体生长及相互作用蛋白分析

作     者：赵秀平 

作者单位：内蒙古民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈永胜;李国瑞

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：蓖麻 谷胱甘肽-S-转移酶 原核表达纯化 晶体生长 相互作用分析 

摘      要：谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferases,GST)是广泛存在于植物体内的多功能蛋白,具有异源物质解毒、转运花青素和天然激素、保护细胞免受氧化以及抗非生物胁迫等多种功能。本课题组在前期研究中筛选到RcGST-F11在红、绿茎蓖麻中差异表达,推测其与蓖麻花青素生物合成代谢相关。通过克隆RcGST-F11基因,建立原核表达纯化体系,筛选晶体生长条件得到蛋白晶体。使用表面等离子共振(SPR)等蛋白质组学技术从蓖麻总蛋白中筛选RcGST-F11的相互作用蛋白,结合酵母双杂交(Y2H)技术点对点验证蛋白间的相互作用关系,旨在为RcGST-F11蛋白的功能、蓖麻花青素生物合成代谢的分子机制及蓖麻抗逆育种奠定理论与实践基础。构建pETM13-RcGST-F11、pHAT2-RcGST-F11等一系列原核重组蛋白表达体系,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,使用IPTG诱导重组蛋白表达。当诱导条件为0.1 mMIPTG,37℃、220 rpm振荡培养5h时,重组蛋白均不可溶。选择通过变复性方式增加His-RcGST-F1 1蛋白的溶解度,发现当以8M尿素(pH 8.0)溶液为变性剂,20mMTris-HCl,pH 8.0,500mMNaCl溶液为复性缓冲液,使用稀释法复性时,该重组蛋白的溶解度较高。使用阴离子交换层析和分子筛层析进一步纯化蛋白,发现该重组蛋白以多聚形式存在,且对低盐具有耐受性。最终成功获得高纯度重组蛋白。使用晶体生长筛选试剂盒进行His-RcGST-F11蛋白的晶体生长试验,当晶体生长池液体积为100μL、蛋白浓度为17.31 mg/mL、样晶体积为2 μL、池液与蛋白比分别为50%:50%和25%:75%,沉淀剂为20%PEG 3350,缓冲液为0.2 M硫酸铵(pH 6.0)时,His-RcGST-F11在样池中产生区别于池液中盐晶形态的生长状态良好,呈现微晶、多晶状态的蛋白晶体。应用SPR技术筛选与RcGST-F 11相互作用的蛋白,以RcGST-F 11为诱饵筛选蓖麻总蛋白,共获得22个相互作用蛋白。Y2H分析显示,当RcGST-F11与RcRBCL发生相互作用时,可在四缺培养基 QDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA)上清晰观察到蓝色菌落,证明RcGST-F11与RcRBCL存在直接相互作用。暂定RcGST-F11与RcRBCL结合,通过3-PGA影响蓖麻中的糖积累,进而影响蓖麻中花青素的积累。以上结果为阐述蓖麻茎色发育的分子机制及蓖麻抗逆育种提供新的视角与实验依据。