玉米纹枯病菌中病毒多样性及新病毒鉴定

作     者：丁金凤 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢甲涛

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：玉米 纹枯病 立枯丝核菌 真菌病毒 真菌病毒多样性 环状RNA病毒 

摘      要：纹枯病菌（Rhizoctonia solani）是重要的死体营养型病原真菌,寄主范围广泛,可以侵染禾本科作物玉米、水稻、小麦等三大农作物,引起严重经济损失。由该病原菌引起的纹枯病是玉米上的重要真菌病害之一,在玉米种植区域频发,影响产量和品质。真菌病毒（mycovirus）是侵染真菌的一类病毒,在各类真菌中普遍存在,已报道的多数真菌病毒为潜伏侵染,但部分真菌病毒可以引起寄主的致病力衰退等低毒特性,具有生物防治潜力。目前,玉米纹枯病菌中的真菌病毒多样性还未曾被报道,本研究主要对玉米纹枯菌中的真菌病毒种类和多样性进行了分析鉴定,发现了新的真菌病毒,研究结果如下:玉米纹枯病菌中真菌病毒种类丰富。从湖北省恩施州建始县和宜昌长阳县两地发病玉米上共分离纯化纹枯菌菌株321株,进行宏病毒组测序,获得60 G数据;通过拼接及序列分析,获得了366条1000 bp以上与已知病毒相关的contig序列,推定这些序列为纹枯病菌中真菌病毒基因组部分序列。根据基因组的类型划分,正单链RNA（+ss RNA）病毒有202个,占比55.2%;单股负义RNA（-ss RNA）病毒有7个,占比1.9%;双链RNA（ds RNA）病毒有137个,占比37.4%;未分类的RNA病毒有20个,占比5.4%;没有发现DNA病毒;在病毒科水平上进行划分,328个真菌病毒序列被暂时分类在17个病毒科,占已明确真菌病毒病毒科的17/26,有38个真菌病毒分类地位未明确;其中隶属于单股负义真菌病毒科（Mymonaviridae）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）、全病毒科（Totiviridae）、番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）的真菌病毒首次在纹枯病菌中被发现。对纹枯菌菌株GD92中真菌病毒组进行了鉴定,发现该菌株被8种真菌病毒复合侵染,其中含有三个具有潜在环状RNA基因组结构的真菌病毒。基于宏病毒组数据分析及RT-PCR检测,发现菌株GD92中有8条与病毒相关的contig序列,所对应真菌病毒分别命名为纹枯病菌反义RNA病毒（Rhizoctonia solani ambivirus 3,RSAV3）、RSAV4、RSAV9、纹枯病菌双分病毒16（Rs PV16）、纹枯病菌欧尔密病毒6（Rs OLV6）、纹枯病菌减病毒3（Rs HV3）、纹枯菌内源病毒1-22（Rs EV1-22）和纹枯病菌弹状病毒（Rs Rh V2）。除了RSAV3、RSAV4和RSAV9的分类地位未确定,其他病毒分别隶属于双病病毒科、葡萄孢欧尔密病毒科、减病毒科、内源病毒科及弹状病毒科等5个病毒科,表明菌株GD92中真菌病毒的种类复杂、丰富。对RSAV3和RSAV4序列进行分析,发现这两个真菌病毒的正反义RNA链分别含有一个完整的、反向的开放阅读框（ORF1和ORF2）,推定ORF1编码Rd Rp,但与已知Rs AV1有低同源,一致性分别为33.53%和25.31%,ORF2编码蛋白在数据库中无同源蛋白且不含任何已知保守结构域,推定编码假定蛋白;基于RSAV3和RSAV4序列设计反向引物进行RT-PCR分析,初步证实该两个真菌病毒具有环状RNA基因组,基因组全长分别含有4848和4806个核苷酸,RSAV3和RSAV4非编码区域核苷酸序列相对保守,二者编码Rd Rp和假定蛋白比对分析,其同一性分别为54%和34%。通过原生质体再生技术,获得了GD92-7菌株,GD92菌株致病力强于菌株GD92-7。本次研究分析了采自湖北恩施州建始县和宜昌市长阳县的玉米纹枯病菌中的真菌病毒多样性,并对单个GD92菌株中含有的真菌病毒种类进行了验证,获得了真菌病毒RSAV3和RSAV4的基因组全长。