肌球蛋白-血清白蛋白复合凝胶形成机制

作     者：费子璇 

作者单位：内蒙古民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王华;倪娜;叶健全

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：肌球蛋白 牛血清白蛋白 二硫键 热处理 圆二色光谱 

摘      要：根据蛋白质的凝胶特性,研究肌球蛋白与牛血清白蛋白在不同比例混合后经热诱导形成复合凝胶的特性。通过保水性、浊度、溶解度、流变、扫描电镜,研究复合凝胶的表观特征。利用Zeta电位、粒径、电泳、圆二色光谱、内源荧光、表面疏水性,分析复合凝胶聚集体系的二、三级结构变化。采用二硫键、对角线电泳、拉曼光谱、蛋白质质谱的方法,研究复合凝胶的二硫键变化。研究结果表明:牛血清白蛋白(BSA)在20mg·m L下不能形成具有良好凝胶特性的凝胶。保水性结果表明,纯肌球蛋白凝胶、肌球蛋白∶BSA复合凝胶15∶5(mg·m L)组、10∶10(mg·m L)组,三组保水性结果相近,5∶15(mg·m L)保水性减弱。动态流变结果表明,在升温的过程中,储能模量G’值在43℃、53℃和61℃出现三个明显的转折,肌球蛋白∶BSA复合凝胶15∶5(mg·m L)组、10∶10(mg·m L)组、5∶15(mg·m L)组的G’值均低于纯肌球蛋白凝胶,说明复合凝胶的弹性特征下降,储能模量G’始终高于损耗模量G’’,这表明复合凝胶形成了一个更具弹性的蛋白凝胶,添加BSA组的tanδ值先低于对照组后高于纯肌球蛋白,说明添加BSA的样品黏性比例增大,与储能模量结论相同。扫描电镜表明肌球蛋白∶BSA复合凝胶10∶10(mg·m L)时,肌球蛋白与BSA分子之间出现交联,孔径较小且均匀,可以形成致密有序的凝胶网络结构。浊度表明BSA能促进肌球蛋白形成凝胶。溶解度升高表明分子间的静电排斥作用大于疏水相互作用,BSA自身携带的静电排斥力促使复合蛋白质的四级结构展开。Zeta电位表明,在肌球蛋白∶BSA复合凝胶10∶10(mg·m L)时Zeta电位绝对值达到最大6.92,此时参与形成凝胶的静电斥力最大,两种蛋白质分子在静电作用力和疏水相互作用下形成新的空间结构。粒径表明,复合凝胶的平均粒径大幅下降,BSA分子在热处理时与肌球蛋白分子形成凝胶,替代部分肌球蛋白分子之间构成凝胶的结合位点,形成较小的交联体。SDS-PAGE电泳表明,肌球蛋白与BSA形成新的蛋白质分子结构。MHC与MLC生成的新二硫键,在还原性电泳下被打开生成巯基。表面疏水性分析结果表明,维持肌球蛋白凝胶三级结构的主要作用力是疏水作用力,肌球蛋白在加入BSA后维持复合凝胶的主要作用力由疏水作用力转变为静电相互作用力。内源荧光表明,在A2时荧光强度达到最高,与BSA相比肌球蛋白∶BSA复合凝胶15∶5(mg·m L)组、10∶10(mg·m L)组、5∶15(mg·m L)组在400nm处峰值均发生蓝移现象,说明发射基团位于更为疏水的微环境。圆二色光谱表明,肌球蛋白∶BSA复合凝胶10∶10(mg·m L)组与纯肌球蛋白组,二级结构含量的百分比相似,α-螺旋为46%、β-转角为17%、无规则卷曲为24%,具有相似的凝胶特性。总巯基与活性巯基表明,复合凝胶的总巯基大部分源于肌球蛋白分子,随着BSA浓度比例升高,总巯基整体含量降低。活性巯基出现先升高又降低的变化趋势。拉曼光谱表明,肌球蛋白∶BSA复合凝胶10∶10(mg·m L)的BSA与肌球蛋白分子结合,形成了新的二硫键,构成了具有良好特性的凝胶,肌球蛋白∶BSA复合凝胶10∶10(mg·m L)组的酪氨酸残基暴露程度最高,为其构成凝胶结构提供一定的疏水作用力。对角线电泳表明,A0与A2在220K Da含有的蛋白或多肽经蛋白质质谱鉴定及Uniprot数据库搜库可推断出为Myosin heavy chain 3蛋白,由分子间SS连接;A0与A2在130K Da时含有的蛋白或多肽经鉴定可推断出为Myosin binding protein C2蛋白,由分子间SS连接;A0与A2在25-20K Da时均出现转折现象的蛋白经鉴定可推断出为两种Myosin light chain 3,其包含的A0A3Q1MBD4和A0A452DI97是真核参考蛋白质以同一基因为中心的同种型两种为分型不同亚型,不能明确其由分子内或分子间SS连接;A0在50K Da时含有两个蛋白或多肽由分子内SS连接,含有三个蛋白或多肽由分子间SS连接,经鉴定可推断出为Actin,或其他杂蛋白。A2在55K Da、50K Da均含有一个蛋白或多肽由分子内SS连接,未出现分子间二硫键,经鉴定可推断出为Albumin和Actin,或其他杂蛋白。蛋白质质谱表明,Myosin-2和Myosin binding protein C2与BSA结合原有的SS断裂,与BSA或肌球蛋白其他分子组成聚合体生成新的大分子肽段;在Myosin heavy chain 3和Myosin binding protein C2与BSA结合生成新的SS,能够维持复合凝胶三级结构的稳定性;肌球蛋白与BSA热处理后,凝胶中的SS在同种蛋白未鉴定分型