抗生素和活性氧簇对大肠杆菌自然遗传转化的影响及临床研究

作     者：梁静 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨丽

授予年度：2022年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：自然遗传转化 抗生素 ROS 大肠杆菌 转录组分析 

摘      要：[目 的]1.探究抗生素对大肠杆菌自然遗传转化的作用及与活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）的关系;确定ROS对大肠杆菌自然遗传转化的作用,初步推测其影响自然遗传转化的下游作用通路,为临床防止耐药细菌的产生提供有益的指导。2.通过研究自然遗传转化过程中氧化压力对基因表达的影响,为探究影响自然遗传转化的下游通路和靶基因提供思路。3.了解临床分离大肠杆菌自然遗传转化能力,并分析其与ESBLs的相关性。[方法]1.在大肠杆菌DH5α液体扩大培养期分别添加不同浓度的卡那霉素、青霉素G、庆大霉素、四环素、亚胺培南、利福平、磺胺甲恶唑、呋喃妥因、左氧氟沙星、环丙沙星、多黏菌素B、氨苄西林、头孢曲松、头孢吡肟、头孢呋辛、头孢唑啉、美罗培南和磷霉素,检测其对自然遗传转化频率的影响。筛选出有显著促进作用的抗生素,并在添加上述抗生素之前添加过氧化氢酶,检测自然遗传转化频率的变化。2.在液体扩大培养期分别添加过氧化氢及超氧化物诱导剂百草枯,后期再补加过氧化氢酶,通过检测自然遗传转化频率,确定ROS对自然遗传转化的作用。3.在液体扩大培养期添加铁离子,检测自然遗传转化频率;加入铁离子螯合剂甲磺酸去铁胺后再添加铁离子,检测自然遗传转化频率的变化,初步探索铁离子偶联ROS在自然遗传转化中的作用。4.在自然遗传转化背景条件下,通过转录组分析过氧化氢引起的基因差异表达情况。5.以标准菌株作为参照,检测临床分离大肠杆菌自然遗传转化频率,并分析其与ESBLs的相关性。[结果]1.浓度为2 μg/mL、4 μg/mL氨苄西林与对照组相比自然遗传转化频率分别提高了 2.5 倍（p0.05）、3.1 倍（p0.05）。5 μg/mL、10 μg/mL 利福平与对照组相比自然遗传转化频率分别提高了 3倍、6.7倍（p0.05）。1 μg/mL、2μg/mL、4 μg/mL、8μg/mL青霉素G与对照组相比转化频率分别提高了 1.6倍、2倍、2.9倍、3倍（p0.05）。0.4 g/mL头孢呋辛与对照组相比转化频率提高了 2.1倍。0.2 μg/mL头孢唑啉与对照组相比转化频率提高了 1.8倍。0.1μg/mL卡那霉素与对照组相比转化频率提高了 2.1 倍。0.0625 μg/mL、0.125 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL 美罗培南与对照组相比转化频率分别提高了 2.7倍、2.9倍、3.3倍、3倍。2μg/mL、4 μg/mL、8μg/mL、16 μg/mL呋喃妥因与对照组相比转化频率分别提高了 1.8倍、1.3倍、2倍、2倍。0.0025 μg/mL、0.005μg/mL左氧氟沙星与对照组相比转化频率分别提高了 3.7倍（p0.05）、3.6倍（p0.05）。0.06 μg/mL环丙沙星与对照相比转化频率提高了 3.7倍。0.005 μg/mL、0.01 μg/mL、0.02μg/mL头孢吡肟与对照组相比转化频率分别提高了 1.5倍、1.9倍、2.1倍。0.05μg/mL亚胺培南与对照相比转化频率提高了 1.2倍。0.05μg/mL头孢曲松与对照组相比自然遗传转化频率提高了 1.3倍。2.液体扩大培养期添加5 U/mL过氧化氢酶后再分别添加4 μg/mL氨苄西林、10μg/mL利福平和8 μg/mL青霉素G,结果表明添加过氧化氢酶可显著降低氨苄西林和青霉素G对自然遗传转化的促进作用（p0.05）,添加过氧化氢酶后添加利福平可一定程度上降低自然遗传转化频率,但降低程度不显著。3.分别添加0.5 mM过氧化氢及0.05 mM百草枯对自然遗传转化均有显著促进作用,转化频率均提高了 2倍左右（p0.05）;分别添加过氧化氢和百草枯后胞外补加5 U/mL过氧化氢酶,结果显示自然遗传转化频率均有所降低,过氧化氢处理的实验组自然遗传转化频率下降具有显著性差异（p0.05）。4.添加0.4 mM铁离子对自然遗传转化有显著促进作用,转化频率提高了 3倍左右（p0.05）,并且在先加入2 mM铁离子螯合剂（甲磺酸去铁胺）后再加入铁离子可显著降低自然遗传转化频率（p0.05）。5.转录组分析结果显示,过氧化氢处理的实验组和对照组间显著差异表达基因共有129个（padj0.05）,包括103个上调基因和26个下调基因。差异基因GO富集分析显示,GO term总共有642个,显著富集的GO term有124个（padj0.05）。生物过程中显著富集的有肽生物合成过程、翻译过程和肽代谢过程等;细胞组分中显著富集的有胞质核糖体、核糖体亚基和核糖核蛋白复合物等;分子功能中显著富集的有核糖体的结构成分、结构分子活性和rRNA结合等。差异基因KEGG富集分析显示,富集的代谢通路共有58条,其中显著富集的有9条（padj0.05）,例如核糖体、光合作用蛋白质、氧化磷酸化等通路。6.46株临床分离的大肠杆菌与标准菌株相比自然遗传转化频率均较低,其中有22株具有显著性差异（p0.05）;产ESBLs的菌有24株,产ESBLs检出率为52%,经相关性分析结果显示,临床分离大肠杆菌自然遗传转化频率与其ESBLs相关系数r=-0.056,p=0.713。[结论]1.氨苄西林、青霉素G、利福平和左氧氟沙星具有显著促进大肠杆菌自然遗传转化的作用。其中氨苄西林、青霉素G促进自然遗传转化的作用与ROS相关。2.超氧化物诱导剂（百草枯）及过氧化氢均能提高自然遗传转化频率,ROS对自然遗传转化有促进作用。3.铁离子对自然遗传转化具有促进作用,可能与ROS协同作用相关。4.过氧化氢处理下大肠杆菌存在基因表达差异,自然遗传转化过程可能涉及多基因和多信号通路参与。5.相比于实验室标准菌株,临床分离大肠杆菌自然遗传转化频率普遍较低,并与其ESBLs无明显相关性。