基于microRNA-466b-5P探讨黄芪-丹参药对改善高血压肾损害的机制研究

作     者：李祥宇 

作者单位：山东中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李伟

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：高血压肾损害 黄芪-丹参药对 miR-466b-5P HAS2 

摘      要：目的:通过收集导师治疗高血压肾损害的方药,分析导师用药规律及核心用药,在此基础上过表达小鼠mi R-466b-5p,分析小鼠肾损害指标,探讨其作用靶点,再使用黄芪-丹参干预,观察小鼠肾损害指标,探讨黄芪-丹参药对通过调节mi R-466b-5p改善高血压肾损害的机制。方法:1.临床研究:采用回顾性研究方法,收集96例导师治疗高血压肾损害的中药处方,借助古今医案云平台软件进行用药频次、四气、五味、归经分析。使用SPSS软件进行聚类分析和关联分析,并筛选出核心药对,进行下一步动物实验研究。2.动物实验:基于本课题组前期mi RNA测序分析,选定了引起高血压肾损害的关键基因mi R-466b-5p,构建腺相关病毒转染小鼠,30只8周龄C57BL/6小鼠,随机选取15只尾静脉注射r AAV-mi R-466b-5P构建mi R-466b-5p过表达组,余15只作为空白对照组注射AAV-9空载体,转染6周后使用成像系统观察小鼠体内荧光情况,分析两组小鼠血压情况,尿β2-微球蛋白（β2-MG）、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、微量白蛋白（m ALB）,血清胱抑素C（Cys-C）、血管紧张素II（Ang II）、C反应蛋白（CRP）水平,两组各随机选取3只小鼠进行肾脏病理切片检测,并进行q PCR与Western blot检测其预测的靶基因及下游基因。评估完成过表达mi R-466b-5P小鼠肾损害情况后再各随机分为2组（n=6）:A组（黄芪-丹参+mi R-466b-5P过表达组）以黄芪配方颗粒:2.036g/kg+丹参配方颗粒:0.255g/kg灌胃;B组（mi R-466b-5P过表达组）以相同体积生理盐水灌胃;C组（黄芪-丹参+空白对照组）以黄芪配方颗粒:2.036g/kg+丹参配方颗粒:0.255g/kg灌胃;D组（空白对照组）以相同体积生理盐水灌胃。灌胃28天后观察各组小鼠尿β2-MG、NAG、m ALB,血清Cys-C、Ang II、CRP水平和肾脏病理,进行RT-q PCR与Western blot检测寻找靶基因。结果:1.临床研究:导师治疗高血压肾损害的主要药物为黄芪91次、丹参80次、当归75次、山药73次、川芎73次、炒白术73次、太子参71次,药物四气以平为主共579次,五味以甘为主共959次,主要归为脾经共841次。导师治疗高血压肾损害的药物主要为补气类和活血类中药。黄芪-丹参为导师治疗高血压肾损害的核心药对,频次为77次,置信度为96%,支持度为80%。2.动物实验:通过测序发现mi R-466b-5p在自发性高血压大鼠（SHR）中高表达,我们构建腺相关病毒以此过表达了C57BL/6小鼠,6周后,通过小动物成像系统观察到小鼠体内的荧光,提示腺相关病毒转染成功,我们进一步检测两组小鼠的血压情况,过表达组血压显著升高（P0.01）。检测小鼠的尿液与血清,小鼠尿中β2-MG、NAG、m ALB显著升高（P0.01）,血清中Cys-C、Ang II、CRP水平显著升高（P0.01）。肾脏出现肾小球硬化、肾小管纤维化等高血压肾损害的病理改变。q PCR检测小鼠肾内mi R-466b-5p的表达水平,过表达组的mi R-466b-5p上调（P0.05）。再检测mi R-466b-5P的潜在功能性靶基因HAS2及HAS2的下游基因。过表达mi RNA-466b-5p小鼠肾脏中,HAS2的m RNA水平明显下调（P0.01）,TGFBR1的m RNA水平明显上调（P0.01）。选取HAS2与TGFBR1进行Western Blot检测,结果显示HAS2的蛋白水平降低（P0.05）,TGFBR1的蛋白水平降低（P0.05）。经黄芪-丹参灌胃后,与D组相比,B组小鼠尿β2-MG、NAG、m ALB、血清Cys-C、Ang II、CRP均显著升高（P0.01）;与B组相比较,A组小鼠血清Cys-C、CRP明显升高（P0.05）,尿β2-MG、NAG、m ALB、血清Ang II无明显改变（P0.05）。与D组相比,B组小鼠出现明显肾小球硬化、小管纤维化,A组较B组有明显改善。与D组相比,B组小鼠透明质酸酶2（HAS2）明显下调,而经黄芪-丹参干预后有所回调。结论:1.临床研究:导师治疗高血压肾损害的主要药物为黄芪、丹参、当归、山药、川芎、炒白术、太子参,药物四气以平为主,五味以甘为主,主要归为脾经,药物主要为补气类和活血类中药,黄芪-丹参为导师治疗高血压肾损害的核心药对。2.动物实验:小鼠过表达mi R-466b-5P后出现高血压肾损害的表现,包括血压升高,尿中β2-MG、NAG、m ALB升高,血清中Cys-C、Ang II、CRP升高,肾脏病理改变等,黄芪-丹参干预后改善过表达mi R-466b-5P小鼠高血压肾损害表现。黄芪-丹参药对的肾脏保护机制,可能与下调mi R-466b-5P、上调HAS2的表达密切相关。