芸豆源抑制黄嘌呤氧化酶活性物质提取及膳食补充剂开发制备
作者单位：华中农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：何慧
授予年度：2022年
学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学]
摘 要：高尿酸血症（HUA）是一种常见的代谢性疾病,其发病率在全世界范围内不断增加。然而,目前在我国临床使用的治疗药物大都具有一定的副作用。黄嘌呤氧化酶（XO）与嘌呤代谢有关,能够调控体内尿酸生成。本室前期研究表明,芸豆源蛋白酶解物具有较好的XO抑制活性。基于花色苷也有抑制XO的活性,本课题以紫花芸豆为原料,充分利用芸豆花色苷和芸豆肽资源,采用液质联用技术对芸豆肽进行结构鉴定,然后利用分子对接技术探究了芸豆肽与XO之间的作用机制;再将含花色苷的醇提物与蛋白酶解物复配,考察复配物稳定性,最终,设计开发一款膳食补充剂,以期用于干预和缓解HUA。主要研究内容和结果如下:1芸豆醇提物及芸豆蛋白质的制备以花色苷含量为指标,确定了酸醇浸提法提取芸豆醇提物的条件:乙醇浓度为65%,液料比为20:1,提取温度为60℃,提取时间为55 min,盐酸浓度为1.0%。在该条件下,醇提物中的花色苷含量为10.29mg/100g。然后利用碱液继续从醇提剩余物中提取芸豆蛋白质,确定了最适的芸豆蛋白质提取方案:碱液浓度为0.05 mol/L,液料比为15:1,提取温度为55℃,提取时间为1h。在最佳提取条件下,芸豆蛋白质的提取率为86.71±0.06%。对芸豆蛋白进行氨基酸分析显示,芸豆蛋白中必需氨基酸的含量约为43.15%,必需氨基酸和非必需氨基酸的比例约为0.759,是一种优质的蛋白质来源,芳香族氨基酸和疏水性氨基酸含量丰富,具有潜在的XO抑制活性基础。2芸豆蛋白酶解物的制备及分子对接研究以芸豆蛋白的水解度及XO的抑制率为监测指标,确定了芸豆蛋白酶解的最适条件为:蛋白质底物浓度为3%,加酶量4%,酶解时间1.5 h,此条件下,XO抑制率为35.14%。利用HPLC-ESI-MS/MS技术对芸豆蛋白酶解物进行结构鉴定,将Abundances值前100的肽段与XO的MOS和FAD两个活性位点进行分子对接,有58条肽段与MOS活性位点结合,100条肽段与FAD活性位点很好地结合,发现肽段可以通过竞争性和非竞争性抑制两种方式抑制XO活性。选取分子对接结果打分最高的两条肽段ISSTE和VLVKPDDRRE分别与其对接活性位点结合并进行可视化分析,发现两条肽段均能通过与活性位点周围的氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用,形成稳定的复合物,进而发挥XO抑制活性。3 醇提物和酶解物复配及其产品开发研究根据芸豆醇提物和蛋白酶解物的得率确定了二者的复配比例为1:0.8,在此复配比例下,XO抑制率为66.80±0.62%。进一步考察复配物在不同温度、不同pH、体外模拟消化、氧化剂、不同光照条件和不同贮藏条件下的稳定性,结果表明,复配物经体外模拟消化后活性提高,光照和短时间的加热处理对复配物的XO抑制活性影响不大,复配物适宜在低温条件下贮藏,应避免与氧化剂接触。根据HUA和痛风患者营养需求,进一步设计了一款膳食补充剂,配方为:乳清蛋白粉添加量6.00 g,酪蛋白添加量1.16 g,麦芽糊精添加量3.20 g,燕麦粉添加量2.00g,植物脂肪粉添加量3.17g,脱脂乳粉添加量5.00g,玉米粉添加量6.40g,大米粉添加量10.26 g,低聚异麦芽糖添加量2.81 g,复合维生素和矿物质添加量1.60 g,复配物添加量1.20g,羧甲基纤维素钠（CMC-Na）添加量0.43g。此配方蛋白质含量丰富,具有较高的营养价值。对添加不同浓度CMC-Na的膳食补充剂进行流变学性质考察,发现所有实验组别均表现出非牛顿的剪切变稀行为和不同程度的滞后现象,综合时间依赖性测试和频率扫描结果显示,CMC-Na添加量为1.0%时,膳食补充剂稳定性较好,符合人体食用要求。膳食补充剂的冲调性和粉体特性结果表明,膳食补充剂宜用温度高于60℃的热水进行冲调食用,在此条件下膳食补充剂的润湿下沉性为145 s,分散时间为23.67 s,溶解性较好。膳食补充剂的休止角、Carr指数、Hausner 比和堆积密度分别为39.13°、30.63%、1.44和0.48 g/mL,能满足工厂应用生产需求。
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