PGAM5与MFRN1相互作用对横纹肌肉瘤细胞的调控及机制研究

作     者：姜迪 

作者单位：东北林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：滕春波

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：MFRN1 PGAM5 CypD 横纹肌肉瘤 

摘      要：铁是生命必需的微量元素,广泛存在于细胞代谢过程中,是许多蛋白质和酶的辅基成分,细胞中多种生物反应过程均依赖于铁的辅助。线粒体是铁代谢的重要场所,线粒体转铁蛋白1（MFRN1）主要负责将细胞质中的铁转运至线粒体中用于血红素和铁硫簇的合成,并与其他铁蛋白一起维护铁稳态。铁稳态失衡会导致线粒体功能障碍,影响机体的正常生理功能,是恶性肿瘤细胞的代谢特征之一,可能与一些疾病的发病机制有关。因此,对线粒体铁代谢的分子机制研究有助于揭示一些疾病的发病机制,为相关疾病的治疗提供理论依据,并对药物的研发具有重大意义。RD细胞是胚胎型横纹肌肉瘤细胞系,是横纹肌肉瘤中最常见的一种,具有恶性程度高预后差的特点,常发于儿童和青少年中。实验室前期研究结果表明,在横纹肌肉瘤中,MFRN1的敲低使亲环蛋白D（Cyp D）磷酸化水平升高,线粒体通透性转换孔（m PTP）开放导致细胞死亡。也有文章报道,磷酸甘油酸变位酶5（PGAM5）被受体激活丝氨酸苏氨酸激酶3（Ripk3）激活使Cyp D磷酸化水平升高,m PTP开放导致细胞死亡。我们猜测MFRN1与PGAM5之间可能存在联系,MFRN1、PGAM5、Cyp D之间也可以相互结合。在本研究中,通过Co-IP实验、纯化蛋白后Pull Down实验、拉曼实验确认MFRN1、PGAM5、Cyp D之间发生相互作用。干涉MFRN1后能够降低PGAM5蛋白表达量,干涉PGAM5后MFRN1的蛋白水平不变。MFRN1是线粒体转铁蛋白,负责将细胞质中的铁离子转入线粒体基质,流式细胞仪检测证实线粒体转铁蛋白对于线粒体中的铁离子含量有重要的作用。实验证明,PGAM5与MFRN1均为铁离子结合蛋白,铁离子可以回复MFRN1敲低导致的PGAM5蛋白量下降,铁离子浓度降低增加PGAM5泛素化,从而降解PGAM5蛋白。本研究证实PGAM5的敲低使Cyp D磷酸化水平升高,并且铁离子可以抑制MFRN1敲低导致的Cyp D磷酸化水平上升,但是在正常的铁离子使用浓度范围内,铁离子对PGAM5的磷酸酶活性没有影响。此外我们确定了PGAM5在肿瘤细胞中的重要性,干涉PGAM5后能够抑制RD细胞的增殖。RD细胞中PGAM5表达量显著高于正常骨骼肌细胞,随后取横纹肌肉瘤病人样本进行免疫组化检测,结果显示PGAM5的表达较高。TCGA数据库分析,PGAM5高表达的肉瘤病人相对于低表达的肉瘤病人生存期较短,在多种肿瘤组织中均检测到PGAM5的高表达。综上,MFRN1的敲低导致线粒体内铁离子含量降低,通过调节泛素化作用使PGAM5蛋白量下降,PGAM5的去磷酸化作用降低,使Cyp D磷酸化水平升高导致m PTP开放而造成细胞死亡。