杨梅素和桑色素对Aβ42/Al3+诱导的大鼠神经系统损伤及细胞凋亡的保护作用

作     者：王欣 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘萍

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：杨梅素 桑色素 阿尔茨海默病 神经损伤 细胞凋亡 

摘      要：[目的]阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)作为一种进行性疾病,因其不断恶化的发病现状和治疗难度,不仅影响着全世界人类的健康,而且日益加剧对社会的负担。AD的发病机制尚未明确,标志性病理特征主要表现为神经原纤维缠结、淀粉样斑块沉积以及大脑皮层和海马区的神经细胞死亡。目前的治疗方法不能完全治愈AD,且伴有不同程度的不良反应。按照多靶点策略的药物开发模式,天然来源的小分子化合物,由于其毒性小、化学结构多样和生物活性广泛的特点,而拥有成为治疗AD药物的巨大潜力和独特优势。其中,黄酮类化合物以其强大的生物学活性一直备受研究者的关注。杨梅素和桑色素属于黄酮类化合物中的黄酮醇亚类,其多羟基、多配位点的化学结构在许多药物筛选实验中表现优越,具有成为抗AD药物的潜力。本研究根据目前最受公认的淀粉样蛋白级联假说,以SD大鼠为实验对象,采用侧脑室注射β淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)联合灌胃铝离子(Al)双干预的方法,建立多因素复合型的AD大鼠动物模型,然后给予杨梅素和桑色素干预。通过对Aβ和Tau(Tubulin-associatedunit)水平、元素水平、炎症因子、细胞凋亡等指标进行多角度的评价和分析,从而探究杨梅素和桑色素对Aβ/A13+诱导的大鼠神经系统损伤及细胞凋亡的保护作用。[方法]96只SD大鼠被随机分为实验组(84只)和阴性对照组(12只)。实验组大鼠脑内注射Aβ(2μg/μL,5μL)和灌胃六水三氯化铝溶液(281.4mg/kg/d,4周),同时,阴性对照组的大鼠脑内注射PBS和灌胃生理盐水。造模结束后,将实验组大鼠随机分为模型组、杨梅素低中高剂量组和桑色素低中高剂量组,每组12只大鼠。低中高干预组分别灌胃50mg/kg/d、100mg/kg/d、200mg/kg/d的杨梅素或者桑色素进行干预,其余组大鼠每天灌胃同体积的干预药溶剂。给药干预8周。最后,每组大鼠随机选取2只制作大脑切片,用于评价神经元凋亡(TUNEL染色)、淀粉样斑块沉积(硫磺素染色)和海马形态(HE染色)的变化情况。其余大鼠分离脑组织和海马并收集血清,-80℃保存以备后续检测分析其他指标。蛋白质印迹法检测大鼠海马组织中Aβ和Tau蛋白的含量,凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(B celllymphoma-2,Bcl-2)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 associated Xprotein,Bax)和炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、白介素-1β(Interleukins-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukins-6,IL-6)的表达水平;实时荧光定量PCR技术检测上述大鼠海马中炎症因子的mRNA表达水平;电感耦合等离子体发射光谱法测定大鼠脑组织和血清中的钙、镁、铜、铝、铁、锌的含量。[结果]1.杨梅素和桑色素对大鼠海马中Aβ和Tau表达的影响与对照组相比,模型组Tau、p-Tau和Aβ蛋白的表达明显升高(p0.05)。与模型组相比,杨梅素高剂量组和桑色素中、高剂量组Aβ蛋白表达显著下降(p0.05)。与模型组相比,杨梅素中、高剂量组和桑色素中、高剂量组的Tau蛋白表达显著下降(p0.05)。与模型组相比,杨梅素中、高剂量组和桑色素低、中、高剂量组的p-Tau蛋白表达显著下降(p0.05)。2.杨梅素和桑色素对大鼠大脑淀粉样纤维斑块沉积情况的影响模型组大鼠脑中的淀粉样纤维斑块的数量比对照组明显增多(p0.05)。与模型组相比,杨梅素中、高剂量组和桑色素中、高剂量组的斑块数量显著下降(p0.05)。3.杨梅素和桑色素对大鼠海马形态的影响对照组大鼠海马细胞呈较为均匀的圆形或椭圆形,结构相对完整,排列整齐,分布紧密。模型组大鼠的海马细胞分布松散,排列紊乱,有许多细胞空泡出现。经过干预,杨梅素中、高剂量组和桑色素高剂量组大鼠的海马细胞分布更加紧密,排列较整齐,细胞空泡也明显地减少。4.杨梅素和桑色素对大鼠海马神经元凋亡的影响与阴性对照组相比,模型组大鼠海马的凋亡细胞占比明显升高(p0.05)。与模型组相比,杨梅素和桑色素干预组的凋亡细胞占比均显著下降(p0.05)。5.杨梅素和桑色素对大鼠海马凋亡相关蛋白表达的影响与阴性对照组相比,模型组大鼠海马中的Bax和C-Caspase-3蛋白的表达明显升高(p0.05)。与模型组相比,杨梅素中、高剂量组和桑色素高剂量组Bax蛋白的表达显著下降(p0.05)。与模型组相比,杨梅素中、高剂量组和桑色素高剂量组C-Caspase-3蛋白明显下降(p0.05)。Bcl-2/Bax的比值显示,模型组比阴性对照组明显下降(p0.05);与模型组比,杨梅素高剂量组和桑色素高剂量组呈现显著上升(p0.05)。6.杨梅素和桑色素对大鼠脑和血清中元素水平的影响铝在所有干预组和模型组大鼠脑中的含量均远远高于阴性对照组(p0.05);与模型组相比,各干预组大鼠脑组织中的铝含量没有明显差异。与阴性对照组相比,模型组大鼠脑中的钙含量明显下降(p0.05);与模型组相比,各干预组大鼠脑中的钙含量没有明显差异。与阴性对照组相比,模型组大鼠脑组织中的铁含量显著上升(p0.05);与模型组相比,杨梅素中剂量组和桑色素高剂量组大鼠脑中的铁含量显著下降(p0.05)。与阴性对照组相比,模型组大鼠脑中的锌含量明显下降(p0.05);与模型组相比,各干预组大鼠脑中的锌含量没有明显差异。各组大鼠脑中的铜和镁元素的含量没有显著差异。与阴性对照组相比,模型组大鼠血清中的钙、铁、镁、锌的含量明显下降(p0.05),但在干预组中与模型组没有统计学差异。各组大鼠血清中的铝和铜元素的含量没有明显差异。7.杨梅素和桑色素对大鼠海马炎症因子的影响与阴性对照组相比,模型组大鼠海马的TNF-α、IL-1β、IL-6和Caspase-1的mRNA表达水平均显著上升(p0.05)。与模型组相比,杨梅素高剂量组和桑色素中、高剂量组大鼠海马的TNF-α的mRNA表达水平显著下降(p0.05),杨梅素中、高剂量组和桑色素中、高剂量组大鼠海马的IL-1β的mRNA表达水平显著下降(p0.05),杨梅素低、中、高剂量组和桑色素低、中、高剂量组的IL-6的mRNA表达水平显著下降(p0.05);杨梅素低、中、高剂量组和桑色素低、中、高剂量组的Caspase-1的mRNA表达水平显著下降(p0.05)。与阴性对照组相比,模型组大鼠海马的TNF-α、IL-1β、IL-6和Caspase-1的蛋白表达水平均显著上升(p0.05)。与模型组相比,杨梅素低、中、高剂量组和桑色素中、高剂量组大鼠海马的TNF-α的蛋白表达水平显著下降(p0.05),杨梅素中、高剂量组和桑色素中、高剂量组大鼠海马的IL-1β的蛋白表达水平显著下降(p0.05),杨梅素中、高剂量组和桑色素中、高剂量组的IL-6的蛋白表达水平显著下降(p0.05),杨梅素中、高剂量组和桑色素低、中、高剂量组的Caspase-1的蛋白表达水平显著下降(p0.05)。[结论]杨梅素和桑色素通过下调炎性细胞因子,缓解脑内的神经炎症;降低Bcl-2家族促凋亡蛋白和Caspase家族凋亡执行蛋白的表达,缓解神经细胞的凋亡进展;螯合脑内的铁元素,减轻大鼠脑内铁的蓄积;降低与AD发生发展直接相关的Aβ和Tau的含量,抑制病理性的淀粉样斑块的形成。因此,杨梅素和桑色素能够改善神经元形态和减轻海马细胞凋亡,对Aβ/Al诱导的大鼠神经系统损伤具有保护作用。