ALDH3B2促进胆管癌进展的作用机制及预后研究

作     者：王悦 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张宗利

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：ALDH3B2 胆管癌 预后 肿瘤标志物 转移 

摘      要：研究背景:胆管癌（cholangiocarcinoma,CCA）是一种源于胆道树的恶性程度极高的肿瘤,近年来,其发病率在全球范围内呈上升趋势,死亡率居高不下。根据原发部位的不同,美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟将CCA进一步划分为iCCA（肝内胆管癌）、pCCA（肝门部胆管癌）和dCCA（远端胆管癌）三种亚型。研究发现,不同解剖位置起源的胆管癌具有其独特的临床特点、治疗方案、预后状态和分子生物学特征。目前,根治性的切除手术仍为有望去治愈CCA的唯一手段。但由于胆管癌的早期症状不典型,出现黄疸、腹痛等症状时往往已处于疾病的晚期,大部分胆管癌病患在诊断CCA时即失去手术根治的机会,导致胆管癌的可切除率较低。另外,胆管癌对放化疗不敏感,也没有可用于一线治疗的靶向药物,对于进展期胆管癌尚缺乏敏感的辅助治疗方案,这些因素共同造成了 CCA患者5年的生存率不到10%的困境。目前,化疗仍是晚期胆管癌的一线治疗方案。随着个体化治疗的发展,靶向治疗、免疫治疗等方案已被证实在特定人群中可以取得较好的治疗效果。通过在分子层面对胆管癌的深入研究,发现针对不同亚型CCA的特异性的肿瘤标志物或潜在的药物靶点,将有助于胆管癌早期诊断、预后分析及靶向治疗的发展。发现可能的胆管癌预后标志物,进一步研究其分子机制等将有利于揭示其是否有作为胆管癌治疗靶点的可能性,并为下一步靶向药物的研究和应用提供参考。醛脱氢酶（ALDH）基因超家族由19个可能具有功能的基因组成,这些基因编码的酶催化醛氧化成相应羧酸,ALDH家族基因突变或单核苷酸多态性均可导致酶活性的降低或丧失,与Sj（?）gren-Larsson综合征、癌症、阿尔茨海默病等严重疾病的发生密切相关。大多数ALDH家族蛋白的功能已经得到了解析。例如ALDH1作为ALDH家族成员之一,在一系列恶性肿瘤中被鉴定为重要的癌症干细胞标记物。ALDH2的基因多态性也被证实与口咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、结直肠癌等的发生具有显著相关性,但ALDH家族在胆管癌中的功能知之甚少,还需要系统的研究。研究目的:1.明确ALDH家族成员在胆管癌组织和相应癌旁组织中的表达情况,发现可能的肿瘤标志物及药物靶点。2.明确ALDH3B2在iCCA,pCCA及dCCA中的表达情况及对患者预后的影响。3.探索ALDH3B2的表达情况与各亚型胆管癌患者临床病理特点的相关性。4.明确ALDH3B2对CCA细胞迁移、侵袭等细胞表型的影响并探索内在机制。研究方法:1.借助高通量测序技术和临床新鲜组织样本,获取CCA癌及癌旁组织的差异基因表达谱,筛选醛脱氢酶家族19个成员进行差异分析。2.收集iCCA、pCCA及dCCA患者的临床新鲜组织样本各6对,利用qRT-PCR技术在mRNA水平明确各亚型的CCA组织和对应癌旁组织中的ALDH3B2的表达情况。3.利用TMA芯片（其中iCCA27例,pCCA87例,dCCA80例）,利用IHC染色检测ALDH3B2蛋白的表达情况并行半定量评分。4.以IHC染色评分6分为界,将iCCA,pCCA及dCCA患者分为ALDH3B2低表达组和ALDH3B2高表达组。利用KM法和对数秩检验等统计学方法对胆管癌中各临床病理特征及ALDH3B2表达水平行单因素分析,探索其对各亚型CCA患者的预后的影响;利用Cox回归模型,分析高表达ALDH3B2是否为各亚型胆管癌患者不良预后的独立风险因素。5.利用卡方检验（Chi-square test）或费希尔精确概率检验（Fisher’s precision probability test）对各型胆管癌的临床病理特征与ALDH3B2的表达水平行相关性分析,明确ALDH3B2的表达水平与各临床病理特征的相关性;6.通过划痕实验、transwell迁移或侵袭实验及尾静脉转移模型明确ALDH3B2的表达水平对CCA细胞迁移和侵袭能力的影响。7.使用Western Blot技术检测EMT相关蛋白的表达变化以明确ALDH3B2对胆管癌细胞EMT的影响。研究结果:1.高通量测序结果显示,与癌旁的正常组织相比,ALDH家族成员ALDH3B2于pCCA的癌组织中mRNA表达显著升高（p0.01）。2.qRT-PCR 的结果中,在 iCCA（p0.001）、pCCA（p0.01）和 dCCA（p0.01）中,相较于癌旁组织,ALDH3B2的mRNA表达均显著升高。3.根据IHC结果示,各个亚型胆管癌的癌组织中均有ALDH3B2蛋白表达。4.经单因素分析可知,在 iCCA（p=0.038）、pCCA（p=0.001）和 dCCA（p=0.026）患者中,ALDH3B2的高表达均与不良预后显著相关。在紧随的多因素分析中,ALDH3B2高表达是iCCA（p=0.047）和pCCA（p=0.042）患者不良预后的独立危险因素。5.相关性分析显示:ALDH3B2的表达水平与pCCA的T分期（p=0.030）,M分期（p=0.048）以及神经浸润（p=0.012）相关,而在iCCA及dCCA中,ALDH3B2的表达水平与临床病理特征的相关性不明显。6.在胆管癌细胞系中敲低ALDH3B2能抑制CCA细胞的体外迁移、侵袭能力并抑制CCA细胞的体内肝、肺转移。7.Western Blot结果证实敲低ALDH3B2能够抑制胆管癌细胞的上皮间充质转化。研究结论:1.相对于癌旁组织,ALDH3B2在iCCA、pCCA和dCCA的癌组织中均显著高表达,差异有统计学意义。2.在各亚型CCA患者中,高表达ALDH3B2的患者预后差,且在iCCA和pCCA患者中,ALDH3B2的高表达是影响预后的独立风险因素。3.ALDH3B2-的高表达能在体内和体外促进CCA细胞的转移,并诱导CCA细胞的上皮间充质转化。