以果蝇翅成虫盘为模型研究Ciz1在器官生长调控中的作用和分子机制

作     者：李晓娇 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：龚瑶琴;孙龚萍

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071008[理学-发育生物学] 

主      题：果蝇 Ciz1 翅盘生长 增殖调控 G2期阻滞 

摘      要：研究背景:器官生长的精确调控对器官的正常发育和功能必不可少。器官大小受细胞体积和细胞数量的影响,而细胞数量则由细胞增殖与死亡决定。果蝇翅成虫盘(简称“翅盘)是成虫翅的前体结构,也是研究器官生长调控和图式形成的常用模型。果蝇翅盘的生长集中在幼虫期,幼虫翅盘的最终大小决定了成虫翅的大小。CIZ1是核基质蛋白,哺乳动物CIZ1被发现参与DNA复制、G1/S期过渡以及X染色体失活,但目前对于CIZ1在器官生长和尺寸调控中的作用还不清楚。我们实验室之前通过RNAi筛选,发现CIZ1在果蝇中的同源蛋白Ciz1是翅盘细胞存活所必需的。研究目的:本研究旨在解析果蝇Ciz1在翅生长发育中的作用和调控机制。方法和结果:1)为了明确果蝇Ciz1在翅生长发育中的作用,我们首先利用tub-Gal4在全身敲低Ciz1,发现全身敲低Ciz1的果蝇在幼虫期致死,幼虫翅盘面积仅为同龄对照翅盘的40%。之后我们特异性地在果蝇翅盘中敲低Ciz1,发现获得的成虫果蝇的翅叶面积为对照果蝇的一半,说明Ciz1是果蝇翅生长所必需的。2)为了明确Ciz1调控翅生长和大小的机制,我们比较了对照翅盘和Ciz1敲低翅盘的细胞大小、增殖和凋亡,发现Ciz1敲低后翅盘细胞增大、增殖减少且凋亡增加。抑制Ciz1敲低引起的细胞凋亡不能拯救翅叶面积的减小,说明敲低Ciz1引起成虫翅叶面积减小的原因主要是抑制了翅盘细胞的增殖。3)我们利用pH3染色、EdU染色以及FUCCI细胞周期报告系统,发现敲低Ciz1不影响DNA复制,而是使细胞周期阻滞在G2期。之后,我们通过qRT-PCR和免疫荧光染色分别检测了 G2/M期过渡的重要驱动蛋白Cyclin B(CycB)的mRNA水平和蛋白水平,发现Ciz1敲低可以引起CycB mRNA水平和蛋白水平的下调。Ciz1可能通过调控CycB的表达促进G2/M期过渡。4)人CIZ1蛋白是核定位蛋白。我们对过表达的果蝇Ciz1蛋白进行免疫荧光染色,发现果蝇Ciz1蛋白也定位在细胞核中。果蝇Ciz1含919个氨基酸,其中两个C2H2型锌指结构域分别位于第476-498位氨基酸和第571-593位氨基酸。我们分别构建了在UAS增强子下表达Ciz1第1-475位氨基酸(Ciz1-N)、Ciz1第476-919位氨基酸(Ciz1-C)以及缺失含有两个锌指结构域的第476-593位氨基酸的Ciz1片段(Ciz1ΔZF)的质粒,并构建了相应的转基因果蝇。我们发现Ciz1-N和Ciz1ΔZF位于细胞核而Ciz1-C位于胞质,说明Ciz1的核定位信号位于N端。我们进而通过分析不同大小的Ciz1片段的亚细胞定位,确定Ciz1的核定位信号位于第73-131位氨基酸内。5)为了明确Ciz1调控增殖和凋亡的功能区域,我们分别在Ciz1敲低的翅盘组织中过表达Ciz1-N、Ciz1-NLSC(73-131+476-919)和Ciz1ΔZF,检测能否拯救Ciz1敲低引起的表型。我们发现Ciz1ΔZF能够拯救敲低Ciz1引起的增殖减少、凋亡增多以及翅叶面积减小,说明Ciz1调控细胞增殖和凋亡不需要锌指结构。表达Ciz1-N可以拯救Ciz1敲低引起的增殖减少、CycB水平降低以及翅叶面积减小,而表达Ciz1-NLSC不能拯救,说明Ciz1的N端执行调控CycB水平和细胞增殖的功能。单独表达Ciz1-N或Ciz1-NLSC都不能拯救Ciz1敲低引起的凋亡增多,说明Ciz1的凋亡调控需要N、C两端共同发挥作用。本研究首次发现了 Ciz1是翅盘生长和翅盘细胞增殖的必需基因,并初步分析了 Ciz1调控细胞增殖的机制以及介导Ciz1调控增殖和凋亡的功能区域,为Ciz1的分子功能研究奠定了基础。