基于水光谱组学的醇类物质对人血清白蛋白保护作用的研究

作     者：杨翠 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：臧恒昌

授予年度：2022年

学科分类：081704[工学-应用化学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 10[医学] 

主      题：人血清白蛋白 红外光谱技术 水光谱组学 二级结构 水合作用 

摘      要：近年来,基于蛋白质结合的生物制剂因其具有较高的特异性和活性,副作用少,越来越多地应用在医学领域中。然而此类药物的发展受到生产成本高昂、药物不稳定性造成的运输和储存困难等影响。冷冻干燥技术可提高蛋白质稳定性和延长货架期,是目前最常采用的制备固体蛋白质的手段。尽管冷冻干燥技术已较为温和,但冷冻和干燥应力仍会造成蛋白质结构的损伤。筛选合适的冻干保护剂,是保证蛋白质结构和活性稳定的方法之一,更是蛋白冷冻干燥生产工艺的关键因素,因此明确保护剂的作用机制是非常关键的理论基础。本研究以人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)为模型蛋白,从简单醇类物质入手,基于红外光谱水光谱组学研究蛋白质分子和醇类物质的相互作用,旨在明确多元醇类保护剂对HSA的保护作用,为蛋白质冷冻干燥生产工艺优化,保护剂配方筛选奠定理论基础。本课题的研究内容包含以下三个方面:(1)水光谱组学用于氘代溶剂体系可行性研究以温度为扰动因素,采集氧化氘(D2O)和双蒸水(H2O)不同温度的中红外光谱(mid infrared spectroscopy,MIRS)和近红外光谱(near infrared spectroscopy,NIRS),当温度升高时,氢键作用减弱,导致水分子团簇的解离,不同水分子结构发生转化,基于对H2O的研究,确定D2O的水物种坐标。基于温度相关NIRS,研究了温度诱导的HSA结构变化,确定HSA在D2O溶剂中的转变温度,同时氘代水分子可以作为联系蛋白质结构变化的纽带,证明了水光谱组学应用于氘代溶剂体系中的可行性。(2)基于红外光谱研究乙醇对人血清白蛋白相变的影响基于MIRS的指针性,明确HSA的二级结构和水合作用的变化。当氘代乙醇浓度低于5%时,氘代乙醇与HSA之间的结合作用主要是疏水作用,氘代乙醇和蛋白质侧链形成氢键结构,促进HSA结构的有序化。采用NIRS对氘代乙醇与HSA的疏水作用进一步探讨。氘代乙醇和HSA的C-H基团结合,包裹极性基团,减少聚集。基于水光谱组学角度分析,强氢键水的存在可以稳定蛋白质的α-螺旋结构从而减缓HSA结构的破坏。结合圆二色谱(circular dichroism,CD)、NIRS 和透射电子显微镜(transmissionelectron microscope,TEM)表明氘代乙醇的加入有效地增加了 α-螺旋结构,抑制了淀粉样纤维结构的形成。表明以水为探针,联系蛋白质结构变化与氢键结构的变化,为探索生命系统中的分子相互作用提供了新的视角。(3)醇的羟基数目对人血清白蛋白二级结构和水合作用的影响利用NIRS和MIRS,研究不同羟基数目的醇类物质对HSA水合层和二级结构的影响。通过NIR差谱分析,发现不同浓度的氘代乙醇和氘代乙二醇的加入会导致中间状态水的差异。通过对溶液的MIR光谱的酰胺Ⅰ带分析,氘代乙醇的加入增强天然结构,氘代乙二醇可以稳定HSA的天然结构。当羟基数目增加时,醇的羟基更多地代替水分子与蛋白质侧链基团进行结合,使周围的水分子更加结构化。水光谱组学的引入为深入揭示醇的保护作用奠定了基础。