基于单类T细胞转录组挖掘猪CD4/CD8互斥分化的关键枢纽基因

作     者：张伟 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱猛进

授予年度：2022年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：猪 T淋巴细胞 抗病能力 互斥分化 胸腺 基因组 枢纽基因 

摘      要：猪疾病问题一直是困扰养猪企业的关键性问题,从遗传上提高猪群的抗病能力已成为了当代育种的重要工作之一。抗病能力往往与自身免疫能力密切相关。T淋巴细胞作为免疫系统的重要组分,其在抵抗疾病方面具有关键作用。因此,从遗传上研究猪T淋巴细胞的产生机理对于间接性提高猪群抗病能力具有重大意义。然而,目前关于猪T淋巴细胞的研究还很少,特别是从全基因组层面去解析猪T淋巴细胞分化发育过程的研究更是少之又少。因此,本研究通过采集仔猪胸腺和肠系膜淋巴结并制成白细胞悬浮液,以CD3、CD4和CD8为抗体标记,结合流式细胞术分选出胸腺的CD4CD8、CD4CD8、CD4、CD84类T细胞亚型,以及肠系膜淋巴结的CD4CD8、CD4、CD83类T细胞亚型,然后对这7类T细胞亚型进行转录组测序,并通过将比较转录组与权重基因共表达网络分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)方法结合起来对其进行分析,挖掘影响猪T淋巴细胞互斥分化的关键枢纽基因(Key hub gene)及其表达变化规律。本研究所获的主要结果如下:(1)流式细胞术和转录组测序获得了7类T细胞亚型的21个样本转录组数据。(2)按T细胞互斥分化路线对21个样本进行成对差异表达分析,共获得5403个差异表达基因;结合WGCNA方法挖掘到了各类T细胞亚型对应的7个主要模块;模块基因GO富集分析结果发现大部分基因主要与免疫调控及T细胞分化过程相关;模块基因PPI(蛋白互作)网络分析结果发现大多数基因具备翻译成蛋白的功能,且蛋白之间存在明显互作关系。(3)通过对各个主要模块的内部基因进行相关性分析,初步挖掘到了各类T细胞亚型的Hub gene;对Hub gene进行网络构建,发现Hub gene之间高度紧密连接。(4)利用cytoHubba软件的7种网络拓扑分析算法筛选到了各T细胞亚型的关键Hub gene,并对关键Hub gene进行网络重构,发现关键Hub gene具有相似的调控模式,即关键Hub gene之间既存在调控,同时又调控着其他Hub gene;此外,关键Hub gene与人和小鼠T细胞互斥分化相关的的重要转录因子进行overlap,发现存在明显差异,表明猪T细胞互斥分化过程存在一套异于人和小鼠的基因调控模式。(5)关键Hub gene表达模式分析和ROC曲线分析发现CDK6、BIRC5、BBS12、ST6GAL1、PNPLA7、KCNAB3、ZFP82基因只在其对应的特定T细胞亚型中高表达,表明关键Hub gene可能决定着各类T细胞亚型的分化方向,可作为对应T细胞亚型的潜在候选标记基因。基于上述研究结果,本研究初步推断了猪T细胞互斥分化通路及其基因表达变化规律:即当某一时期的T细胞亚型开始分化时,决定新状态的关键Hub gene会开启或高表达,同时,决定原状态的关键Hub gene会关闭或低表达。本研究不仅加深了对猪T细胞互斥分化机制的分子认知,而且为猪抗病育种提供了一定的候选基因信息。