靶向PKM2增强婴幼儿血管瘤治疗敏感性的机制研究

作     者：杨恩黎 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张东升

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：婴幼儿血管瘤 普萘洛尔 PKM2 治疗敏感性 血管瘤内皮细胞 

摘      要：研究目的:婴幼儿血管瘤(IH)是婴儿时期最常见的良性肿瘤。目前,普萘洛尔已经成为治疗IH的一线药物。近来研究表明,部分患儿对普萘洛尔治疗敏感性降低,成为IH治疗失败的一个重要因素,但其具体作用机制不清。有大量研究表明一种重要的糖酵解关键酶--丙酮酸激酶M2(PKM2),在调节肿瘤的进展和治疗敏感性方面起着重要作用。本研究旨在阐明PKM2对IH发生发展的影响,进一步探究PKM2在IH治疗敏感性方面的作用机制。研究方法:1.首先分离、培养血管瘤内皮细胞(HemEC),通过慢病毒转染构建敲低或过表达PKM2的HemEC细胞,然后通过CCK实验、EdU染色、细胞划痕实验、管腔形成实验,检测敲低或过表达PKM2对HemEC细胞生物学行为的影响。构建血管瘤裸鼠模型,通过体内实验进一步验证PKM2对IH进展的调控作用。2.使用免疫组织化学法检测对普萘洛尔敏感性不同的IH样本中的PKM2表达。构建PKM2过表达的HemEC细胞模型,然后通过CCK实验、Western Blot实验、流式细胞术检测普萘洛尔对过表达PKM2的HemEC细胞增殖和凋亡的影响;通过CCK实验、Western Blot实验、流式细胞术检测紫草素和普萘洛尔联用对过表达PKM2的HemEC细胞的抑制作用。构建血管瘤裸鼠模型,通过体内实验进一步验证普萘洛尔和紫草素对IH的抑制作用。研究结果:1.体外实验证实,敲低HemEC细胞中PKM2后,HemEC细胞的增殖、迁移、成血管能力受到抑制;相反,PKM2过表达的HemEC细胞的增殖、迁移、成血管能力明显提高。在体内实验中,PKM2敲低组瘤体颜色较阴性对照组显著变浅,微血管密度(MVD)值和瘤体组织中VEGF表达更低;而PKM2过表达组瘤体颜色较阴性对照组明显变深,且MVD值和瘤体组织中VEGF表达升高。2.在对普萘洛尔敏感性不同的IH病例中,发现治疗敏感性降低的IH样本中PKM2的表达明显升高。过表达PKM2的HemEC细胞对普萘洛尔的敏感性降低,药物的IC50升高;且细胞凋亡较对照组明显降低。当与紫草素联用时,过表达PKM2的HemEC细胞对普萘洛尔的敏感性明显提高,且细胞凋亡较单用普萘洛尔组明显升高。体内实验表明,相较于单用普萘洛尔,联用紫草素联后,瘤体的颜色明显更浅,MVD值降低,组织标本中凋亡相关蛋白Bax和Cleaved caspase3表达升高。各组裸鼠均无明显体重下降,各组主要器官心、肺、肝、肾和脾脏等均无明显组织结构破坏。研究结论:PKM2促进了 HemEC细胞的增殖、迁移和血管生成,且在体内PKM2对移植瘤有明显促进作用。当与紫草素联用时,能明显增强普萘洛尔对HemEC细胞的抑制作用,在体内实验中得到进一步证实,提高了普萘洛尔对IH的治疗敏感性,且不伴有明显全身毒性,具有潜在的临床应用前景。