小鼠小脑平行纤维到浦肯野细胞突触传递在吗啡条件性位置偏爱中的作用

作     者：白金 

作者单位：延边大学 

学位级别：硕士

导师姓名：兰艳

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071006[理学-神经生物学] 

主      题：平行纤维 浦肯野细胞 突触传递 条件性位置偏爱 μ-阿片受体 

摘      要：[目的]采用脑立体定位注射、化学遗传学、行为学、免疫荧光染色、全细胞膜片钳及神经药理学方法,探究小鼠小脑平行纤维（parallel fiber,PF）到浦肯野细胞（Purkinje cell,PC）突触传递在吗啡条件性位置偏爱（conditioned place preference,CPP）中的作用。[材料与方法]1.实验动物选取6-8周龄成年雄性昆明小鼠,体重22±2 g,随机分为吗啡（Morphine）组和生理盐水（Saline）组。Morphine组小鼠接受连续5天的吗啡CPP训练,上午腹腔注射生理盐水（10 mg/kg）后立即放入偏爱箱一侧（该侧定义为伴生理盐水侧）30 min,下午腹腔注射盐酸吗啡（10 mg/kg）后立即放入另一侧（该侧定义为伴吗啡侧）30 min;Saline组小鼠接受同样的实验操作但上午和下午均腹腔注射生理盐水。测试阶段,分别将两组小鼠放入无隔板的CPP箱中自由探索15 min,记录其在每侧停留时间。在伴吗啡侧停留时间减去在伴盐水侧停留时间得到的时间差值即为吗啡CPP评分。2.在CPP测试后48 h内,将小鼠经异氟烷吸入麻醉后迅速断头取脑,制备300μm厚度的小脑矢状切片,将脑片迅速转移至室温条件下充分含有O2（95%）和CO2（5%）混合气体的人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF）中孵育,约60 min后进行全细胞膜片钳记录。在picrotoxin（GABAA受体阻断剂）和TTX（钠离子通道阻断剂）存在且钳制电压为-70 m V条件下,记录PC的微小兴奋性突触后电流（mini excitatory postsynaptic current,m EPSC）。3.将小鼠随机分为对照组和h M4D（Gi）组,并分别在小鼠小脑Vermis区颗粒细胞层（granular cell layer,GCL）注射p AAV-Ca MKⅡa-MCS-m Cherry和p AAV-Ca MKⅡa-h M4D（Gi）-m Cherry病毒。在病毒注射后第17天,行核团置管手术。术后恢复3天进行后续实验。在吗啡CPP实验中,每次吗啡CPP训练前15min,经微量注射泵以180 nl/min的速率向小鼠小脑GCL注射叠氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide,CNO）0.3μl,100 s完成给药。旷场实验在病毒注射前（第0天）,病毒注射半个月后（第16天）及核团置管手术3天后（第20天）进行,以评估两组小鼠核团注射病毒前后及埋管前后运动能力的变化。4.同上,对照组和h M4D（Gi）组小鼠在吗啡CPP测试后48 h内,将小鼠经4%多聚甲醛灌流后取脑,OCT包埋后灌流取脑后用冰冻切片机制备厚度为15μm的小脑矢状切片,进行免疫荧光实验检测病毒及VGlut 1表达情况。5.注射病毒小鼠在吗啡CPP测试后48 h内,经异氟烷吸入麻醉后断头取脑行全细胞膜片钳实验。在picrotoxin存在条件下,小脑脑片表面灌流CNO,记录对照组和h M4D（Gi）组小鼠PC的自发性兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic current,s EPSC）。在picrotoxin和CNO同时存在条件下,脑片表面灌流DAMGO观察对照组和h M4D（Gi）组s EPSC的变化情况。6.所有数据均用mean±SEM表示,采用单因素方差分析（One-way ANOVA）、双因素方差分析（Two-way ANOVA）,Mann-Whitney检验和两独立样本T检验分析数据是否存在统计学意义。P值小于0.05被认为存在显著性差异。[结果]1.CPP训练后,Morphine组小鼠与Saline组小鼠相比,CPP评分明显提高（P0.05）。2.Morphine组小鼠PCs m EPSC的幅值与Saline组相比明显增加（P0.05）,频率减小（P0.05）。3.免疫荧光结果显示化学遗传学病毒标记神经元与小脑Vermis区GCL谷氨酸能神经元重合。4.对照组和h M4D（Gi）组小鼠病毒注射0天、16天及20天在旷场实验中的运动总距离没有统计学差异（P0.05）,h M4D（Gi）组小鼠吗啡CPP评分较对照病毒组明显增高（P0.05）。5.对照组小鼠小脑切片,在picrotoxin存在条件下,灌流CNO不改变PC s EPSC的频率和幅值（P0.05）;h M4D（Gi）组小鼠脑片灌流CNO时则明显降低PC s EPSC的频率（P0.05）,但幅值不变（P0.05）。6.对照组和h M4D（Gi）组小鼠小脑脑片,在picrotoxin和CNO存在条件下,灌流DAMGO均使PC s EPSC的频率明显降低（P0.05）而幅值不变（P0.05）,且h M4D（Gi）组小鼠PC s EPSC频率下降程度明显大于对照组（P0.05）。[结论]1.小鼠小脑皮层PF-PC突触传递可能参与吗啡CPP的形成过程。2.抑制小鼠小脑皮层PF-PC突触传递促进吗啡奖赏效应的形成,该过程可能与突触前μ-阿片受体（mu opioid receptor,MOR）有关。