BALB/c小鼠致敏模型建立及Komagataella phaffii表达猪肌红蛋白的潜在致敏性评价

作     者：徐佳媛 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王加生;孙秀兰

授予年度：2022年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100403[医学-营养与食品卫生学] 10[医学] 

主      题：食物过敏 致敏性评价 肠道菌群 代谢组学 微生物发酵猪肌红蛋白 

摘      要：近年来,食物过敏在全球的发病率日益增高,已成为威胁人类健康的公共性食品安全问题之一,对食物过敏患者造成了沉重的生理和心理负担。另一方面,资源短缺、环境污染等可持续发展问题对清洁、高产能的新型蛋白资源提出需求,比如昆虫蛋白、微生物来源蛋白、基因工程表达蛋白等新型蛋白资源或生产技术。然而这些蛋白存在致敏性风险,会对食物致敏风险管理带来新的挑战,致敏性评价将成为保证未来食品安全的基础。目前用于评价食物致敏性的金标准方法为以人为研究对象的双盲对照膳食挑战试验,但执行难度大、风险高。动物模型虽已广泛用于食物致敏性评价,但现有的评价指标体系无法反映食物过敏发生的机理变化,难以预测受试物的潜在致敏能力大小。改善致敏风险评价模型,完善致敏性评价指标体系,对于合理控制未来食品致敏是必要的。本论文以卵清白蛋白（OVA）作为食物过敏阳性物,成功构建了食物过敏BALB/c小鼠模型,引入肠道菌群与血清代谢组联合免疫生化指标分析以完善致敏性评价体系,并将所建立的致敏性评价模型应用于基因工程Komagataella phaffii所表达猪肌红蛋白致敏性的评价。基于评价结果,结合体外评价方法综合分析表达蛋白发酵液中的致敏性组分,为其生产纯化工艺的优化及安全风险的控制提供了方向,主要研究内容及结果如下:（1）通过多次灌胃及腹腔注射激发的方式成功构建食物过敏BALB/c小鼠模型。以OVA为过敏阳性物,通过灌胃给予5次OVA,每次间隔7天,末次灌胃后7天腹腔注射OVA处理BALB/c小鼠。小鼠在腹腔注射OVA后60 min内出现搔鼻、竖毛、活动减少等过敏症状,血清中的OVA特异性免疫球蛋白G（Ig G）、免疫球蛋白E（Ig E）、组胺（HIS）、单核细胞趋化蛋白-1（m MCP-1）各项免疫相关生化指标均显著上升。通过分离小鼠活性脾淋巴细胞,免疫荧光染色、流式细胞仪分选及体外过敏原再刺激验证,经OVA处理的小鼠脾淋巴细胞中辅助型T细胞1/辅助型T细胞2（Th1/Th2）平衡向Th2型分化,发生了由OVA特异性引起的Th2型免疫反应,表明OVA过敏小鼠模型构建成功。（2）经过血清代谢组学与肠道菌群检测与分析及多组学联合免疫生化指标数据挖掘,发现在BALB/c小鼠中,OVA过敏的发生与肠道菌群及血清代谢组的变化存在紧密联系。通过分析OVA处理组小鼠肠道菌群的α-多样性、群落组成特征及与对照组小鼠之间的β-多样性,发现OVA过敏小鼠肠道菌群物种丰度明显下降,群落组成特征改变,共发现12种显著差异的菌群（科水平）。OVA过敏小鼠血清代谢组发生显著改变,共发现18种差异代谢物（p0.05,投影值的变量重要性（VIP）1,变化倍率（FC）1.5）。肠道差异菌群、差异代谢物及免疫生化指标之间的相关性分析,结合肠道功能预测及血清代谢物通路富集分析,发现肠道中的Muribaculaceae、Erysipelotrichaceae、理研菌科、乳杆菌、梭菌纲等物种,血清中的吲哚代谢衍生物及氨酰-t RNA生物合成通路丰度与食物过敏的发生存在关联。（3）将所建立的致敏性评价模型应用于Komagataella phaffii所表达猪肌红蛋白的致敏性评价,发现酵母表达产生的猪肌红蛋白提取液具有致敏性,致敏性可能由杂质组分产生。BALB/c小鼠分别多次灌胃给予及单次腹腔注射60%纯度与88%纯度的发酵猪肌红蛋白后,均出现搔鼻、活动减少或竖毛等过敏症状,血清及T细胞分析等免疫指标显著上升,但60%纯度发酵猪肌红蛋白处理的小鼠多项免疫生化指标改变程度高于88%纯度发酵猪肌红蛋白。60%纯度组肠道菌群发生了与OVA过敏小鼠相似的由过敏引起的变化,包括多种差异菌群丰度、肠道氨酰t RNA合成通路丰度改变,而88%纯度组仅表现出相似改变的趋势,改变程度低于60%纯度组。与猪肌红蛋白结构功能相似的天然猪血红蛋白纯品未表现出致敏性。（4）过敏原序列相似性检索与体外模拟消化实验分析显示猪肌红蛋白本身不具有致敏性,造成发酵蛋白提取液具有致敏性的组分为杂质物质。将猪肌红蛋白序列与Allergen Online（AOL）及美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行相似性检索,未发现猪肌红蛋白与现有过敏原或有毒蛋白存在交叉反应的可能性。60%纯度和88%纯度的发酵猪肌红蛋白提取液中的主要蛋白条带在体外消化后被降解,说明猪肌红蛋白不具有抗消化特性。结合小鼠模型评价结果,推断酵母表达产生的猪肌红蛋白本身不具有致敏性,产生致敏性的为杂质组分,为微生物表达猪肌红蛋白生产纯化工艺的优化及安全风险控制提供了方向。