HOXA11-OS靶向miR-124-3p介导Cyr61调控足细胞自噬参与狼疮性肾炎的分子机制研究
作者单位：右江民族医学院
学位级别：硕士
导师姓名：尤燕舞
授予年度：2022年
主 题：狼疮性肾炎 足细胞 HOXA11-OS Cyr61 自噬 慢病毒 HOXA11-OS/miR-124-3p/Cyr61 MRL/lpr狼疮小鼠 腺相关病毒
摘 要：第一部分HOXA11-OS、Cyr61和自噬因子在狼疮性肾炎和足细胞中的表达分析目的:通过检测正常小鼠及狼疮小鼠肾组织、正常足细胞及损伤足细胞中长链非编码RNA HOXA11-OS（Long non-coding RNA HOXA11-OS,lnc RNA HOXA11-OS/HOXA11-OS）和富含半胱氨酸61（Cysteine rich 61,Cyr61）的表达水平,同时检测狼疮性肾炎（Lupus Nephritis,LN）和足细胞模型中是否存在异常自噬。初步分析及探讨HOXA11-OS、Cyr61及自噬在LN和足细胞中的作用。方法:选取4月龄C57BL/6J雌性小鼠作为正常对照组、MRL/lpr雌性小鼠作为狼疮组,每组6只。采用尿蛋白检测试剂盒和肌酐/尿素氮检测试剂盒分别检测各组小鼠尿液中24小时尿蛋白和血清肌酐（Serum creatinine,Scr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen,BUN）水平。苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色观察肾组织病理改变。酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组小鼠血清抗ds DNA抗体、ANA抗体、抗Sm抗体水平。使用狼疮患者血清提取的自身抗体IgG诱导足细胞以模拟LN中损伤的足细胞以建立体外细胞炎症模型,通过细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测狼疮患者血清抗体IgG作用于足细胞后的细胞活力,选取最佳诱导浓度和时间。应用慢病毒在足细胞中构建过表达和敲低HOXA11-OS的稳转细胞株。采用实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）、蛋白免疫印记（Western blot）检测小鼠肾组织和足细胞中HOXA11-OS、Cyr61和自噬因子程序性死亡受体-1（Programmed cell death-1,Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3B（Microtubule associated protein1light chain 3 B,LC3B）的表达水平,同时检测足细胞标志蛋白nephrin、podocin的表达水平。免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测细胞中nephrin、LC3B、Cyr61蛋白的定位及表达量。结果:（1）HOXA11-OS、Cyr61和Beclin-1、LC3B在狼疮小鼠和体外细胞模型中均显著高表达,差异均有统计学意义（P0.05）。（2）在体外,狼疮自身抗体IgG诱导的足细胞活力和自噬水平呈浓度和时间依赖性。过表达HOXA11-OS可以使Cyr61和自噬因子水平明显增加,足细胞损伤明显,而敲低HOXA11-OS后可以使Cyr61和自噬因子水平明显下降,足细胞损伤程度得到减轻,差异均有统计学意义（P0.05）。结论:HOXA11-OS在LN的发生发展过程中起重要作用,同时HOXA11-OS也可调控足细胞中Cyr61的表达和自噬作用,进而影响肾脏和足细胞功能。第二部分HOXA11-OS在足细胞损伤中靶向miR-124-3p介导Cyr61调控自噬的机制研究目的:Lnc RNA可作为一种竞争性内源性RNA（Competitive endogenous RNA,ce RNA）与miRNA相互作用,参与靶基因的表达调控。HOXA11-OS作为lnc RNA中的一种,也可能作为ce RNA与miR-124-3p进行互相调节,进而发挥生物学功能。本研究通过检测足细胞中miR-124-3p、Cyr61的表达水平,分析HOXA11-OS、miR-124-3p、Cyr61三者间的相关性,进一步探究HOXA11-OS在足细胞损伤过程中参与调控自噬的潜在机制。方法:应用慢病毒在足细胞中构建过表达和敲低miR-124-3p的稳转细胞株及敲低Cyr61的稳转细胞株。通过FISH实验检测HOXA11-OS在细胞中的定位。随后通过数据库查找HOXA11-OS、miR-124-3p和Cyr61三者间的结合位点,并通过双荧光素酶实验验证三者之间的调控关系。分别共转染过表达HOXA11-OS和miR-124-3p、敲低HOXA11-OS和敲低miR-124-3p、过表达HOXA11-OS和敲低Cyr61。分别采用q RT-PCR、Western blot、IF方法检测HOXA11-OS、miR-124-3p、Cyr61、Beclin-1、LC3B、nephrin、podocin的表达水平。结果:（1）FISH实验结果提示HOXA11-OS在细胞核与细胞质中均有分部,主要分布在细胞质中。双荧光素酶实验结果提示miR-124-3p与HOXA11-OS、miR-124-3p与Cyr61具有结合位点,且通过预测的结合位点相结合（P0.01）。（2）分别过表达或敲低HOXA11-OS后miR-124-3p的表达呈降低或升高（P0.001）,而Cyr61的表达呈升高或下降（P0.05或P0.01）。（3）在共转染过表达HOXA11-OS和miR-124-3p后,与过表达HOXA11-OS组比较,细胞中Beclin-1、LC3B和Cyr61的表达水平上升后恢复（P0.05）,nephrin、podocin的表达水平下降后回升（P0.05）,足细胞损伤减轻。而共转染敲低HOXA11-OS和敲低miR-124-3p后,与敲低HOXA11-OS组比较,细胞中Beclin-1、LC3B和Cyr61的表达水平下降后回升（P0.05）,nephrin、podocin的表达水平升高后回降（P0.05）,足细胞损伤加重。（4）回复实验中,共转染过表达HOXA11-OS和敲低Cyr61病毒后,与过表达HOXA11-OS组比较,细胞中Beclin-1、LC3B的表达水平上升后回降（P0.05）,nephrin、podocin的表达水平下降后回升（P0.05）,足细胞损伤减轻。结论:在足细胞损伤中HOXA11-OS可能通过吸附miR-124-3p,抑制miR-124-3p对靶基因的降解能力,从而正向调控Cyr61的表达及自噬作用。敲低Cyr61后可缓解过表达HOXA11-OS所致的自噬因子异常升高,降低足细胞损伤程度。第三部分HOXA11-OS通过靶向miR-124-3p介导Cyr61参与狼疮性肾炎的机制研究目的:以HOXA11-OS为关键点,在细胞水平的基础上从体内实验进一步验证HOXA11-OS在LN发生发展过程中的分子机制。在狼疮小鼠体内注射腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）构建敲低HOXA11-OS和敲低miR-124-3p小鼠模型,同时以C57BL/6J正常小鼠作为对照,检测肾脏组织自噬的情况,评估小鼠尿蛋白、自身抗体及肾脏功能的改变。同时分析Cyr61蛋白与LN发生发展的关系。进一步验证HOXA11-OS靶向miR-124-3p介导Cyr61参与LN发生发展的机制。方法:选取4月龄C57BL/6J雌性小鼠和MRL/lpr雌性小鼠,随机分为8组,每组6只:对照组（正常小鼠体内注射阴性对照的AAV）、敲低HOXA11-OS组（正常小鼠体内注射敲低HOXA11-OS的AAV）、敲低miR-124-3p组（正常小鼠体内注射敲低miR-124-3p的AAV）、敲低HOXA11-OS+敲低miR-124-3p组（正常小鼠体内注射敲低HOXA11-OS的AAV和敲低miR-124-3p的AAV）、狼疮组（狼疮小鼠体内注射阴性对照的AAV）、狼疮敲低HOXA11-OS组（狼疮小鼠体内注射敲低HOXA11-OS的AAV）、狼疮敲低miR-124-3p组（狼疮小鼠体内注射敲低miR-124-3p的AAV）、狼疮敲低HOXA11-OS+敲低miR-124-3p组（狼疮小鼠体内注射敲低HOXA11-OS的AAV和敲低miR-124-3p的AAV）。采用尿蛋白检测试剂盒和肌酐/尿素氮检测试剂盒分别检测各组小鼠尿液中24小时尿蛋白和血清肌酐、尿素氮水平。苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色和过碘酸雪芙（Periodic Acid-Schiff,PAS）染色检测各组小鼠肾组织的病理改变。ELISA检测各组小鼠血清抗ds DNA抗体、ANA抗体、抗Sm抗体水平。q RT-PCR、Western blot检测各组小鼠肾组织中HOXA11-OS、Cyr61、Beclin-1、LC3B、nephrin、podocin的表达水平。IF检测各组小鼠肾组织中nephrin、LC3B、Cyr61蛋白的表达水平。结果:与狼疮组比较,敲低HOXA11-OS后狼疮小鼠尿蛋白、血清尿素氮、肌酐和抗ds DNA抗体、ANA抗体、抗Sm抗体水平明显下降（P0.05）,肾组织中HOXA11-OS、Cyr61、Beclin-1、LC3B的表达水平明显降低（P0.01）,nephrin、podocin的表达水平明显升高（P0.05）,肾脏炎症病变得到改善;而敲低miR-124-3p后,狼疮小鼠尿蛋白、血清尿素氮、肌酐和抗ds DNA抗体、ANA抗体、抗Sm抗体水平明显明显升高（P0.05）,肾组织中HOXA11-OS、Cyr61、Beclin-1、LC3B的表达水平明显升高（P0.01）,nephrin、podocin的表达水平明显降低（P0.05）,肾脏炎症病变加重。与狼疮敲低HOXA11-OS组比较,同时注射敲低HOXA11-OS和miR-124-3p病毒后,狼疮小鼠尿蛋白、血清尿素氮、肌酐和抗ds DNA抗体、ANA抗体、抗Sm抗体水平明显回升（P0.05）,肾组织中HOXA11-OS、Cyr61、Beclin-1、LC3B的表达水平明显升高（P0.05）,nephrin、podocin的表达水平明显降低（P0.01）,逆转了敲低HOXA11-OS的作用,肾脏损害加重。结论:在狼疮性肾炎小鼠肾组织中HOXA11-OS可能通过海绵作用吸附miR-124-3p,抑制miR-124-3p对靶基因的降解能力,从而正向调控Cyr61基因的表达及自噬因子的作用,参与LN的发生发展。敲低HOXA11-OS可明显减轻系统性红斑狼疮导致的肾脏损伤。
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