基于GR-5 DNAzyme和等温扩增策略的Pb2+高灵敏、无酶荧光检测体系的构建及性能研究
作者单位：上海海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：吴继魁
授予年度：2022年
学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境]
摘 要：随着社会经济发展进入全面工业化的阶段,重金属污染的问题越来越受到人们的关注。重金属是环境和水资源的主要污染物之一,特别是铅离子(Pb)污染严重危害到人类健康。现有研究表明铅离子即使在低浓度的情况下也会对人体多个部位如神经系统、消化系统、造血器官、心血管和肾脏等造成严重损害,另外还会对环境造成严重污染,因此对环境中痕量Pb的监测具有重要意义。Pb传统的检测方法往往存在很多局限性,不能够快速高效低成本检测铅离子。因此,建立低成本、简单快速、高灵敏、高选择性的Pb检测方法具有重要的研究意义。脱氧核酶(DNAzyme),是通过体外选择获得的具有催化活性的DNA分子,具有出色的可编程性、稳定性和催化活性,已在治疗和诊断应用领域引起了广泛关注。迄今为止,DNAzyme作为生物传感器的重要识别元件检测重金属Pb已得到广泛应用。基于DNAzyme的生物传感器根据检测信号的不同可以分为荧光型、比色型和电化学型。核酸的等温扩增可以在恒定的温度下快速有效地扩增核酸序列。与传统的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相比,等温扩增无需进行升降温的热循环,对仪器的精密度要求降低,使操作时间缩短,过程简单且能耗低,而且具有很高的灵敏度,可整合到便携式设备中,有利于现场实时的检测,是代替PCR方法的一种高效扩增核酸技术。主要的等温扩增方法包括环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、解旋酶依赖性扩增(Helicase-Dependent Amplification,HDA)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)、链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)、催化发夹组装(Catalytic Hairpin Assembly,CHA)和杂交链反应(Hybridization Chain Reaction,HCR)等。近年来,等温扩增技术与Pb特异的DNAzyme结合构建生物传感体以实现快速、高灵敏、高特异地检测Pb。本论文以GR-5 DNAzyme为识别元件,与核酸等温扩增策略相结合,利用两种不同的设计思路,构建了无酶、高效、低成本、高特异的Pb检测体系,并对其进行性能研究,具体工作包括如下:1.基于发夹DNA动态自组装树枝状聚合物放大策略的荧光传感体系无酶高灵敏检测Pb以GR-5 DNAzyme为Pb特异性识别探针、DNA动态自组装为扩增信号放大策略,构建了一种无酶高灵敏的Pb荧光传感体系。首先将三条DNA单链Y1、Y2、Y3结合形成三臂的Y骨架并与三个发夹H1、H2、H3结合形成许多发夹型三聚体。Pb特异性识别并激发GR-5 DNAzyme的催化活性,使底物链裂解,释放目标链(Target);然后Target将含有目标链识别域的发夹H1打开并与识别域结合;与此同时,H1暴露出的部分将另一个发夹型三聚体上的发夹H2打开并与其识别域结合形成含有两个三臂的聚合物,并将第三个发夹型三聚体上的H3打开与其识别域结合形成含有三个三臂的聚合物,同时H3将Target从聚合物中置换出来以催化下一个动态的自组装过程,最终形成树枝状聚合产物。在此过程中,发夹H1被打开时,上面修饰的荧光团和猝灭团分开,产生荧光信号,由此可实现对Pb的高灵敏检测。在优化实验条件下,该检测体系能够在40 min内完成对Pb的无酶荧光检测,其线性范围是0.1～10 n M,检测限为18.96 p M。该方法单管操作、恒温进行、无需蛋白酶辅助,并成功应用于检测实际水样中的Pb。2.基于GR-5 DNAzyme和熵驱动等温循环放大体系的Pb高灵敏、无酶荧光检测体系的构建及性能研究基于GR-5 DNAzyme和分子信标(Molecular Beacon,MB)级联熵驱动的链置换反应构建了无酶的荧光传感体系。荧光基团Cy3修饰在MB的5′端,猝灭基团BHQ2修饰在MB的3′端。在Pb存在时,GR-5 DNAzyme特异性识别Pb,其催化活性被激发,从而裂解底物链并使之释放出靶标链(Target),然后通过熵驱动链置换反应从所制备的三链复合物中置换出大量信号探针(Signal Probes,SP),通过SP和MB的杂交,使MB两端修饰的荧光基团和猝灭基团分开,从而产生荧光信号,实现对Pb的特异性检测。当Pb不存在时,GR-5 DNAzyme的底物链不被切断,无法释放Target,也就无法触发熵驱动链置换反应释放SP,故检测体系没有荧光产生。该荧光传感体系对Pb的特异性强,通过熵驱动链置换反应放大荧光信号,从而实现Pb浓度的定量分析。其线性检测范围为0.01～10n M,检出限为2.4 p M。此传感器具有良好的选择性和高灵敏性
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