hESCs诱导“仿生羊膜”向ESLCs转化的实验研究

作     者：张水勤 

作者单位：遵义医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖雁冰

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：间充质干细胞 子宫内膜间质细胞 脱细胞羊膜 诱导分化 

摘      要：目的:探索在Transwell共培养条件下,人子宫内膜间质细胞对种植在人脱细胞羊膜上的人羊膜间充质干细胞的定向诱导作用。方法:人羊膜组织分离获取人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs）,行流式细胞学表型及免疫荧光对h AMSCs进行鉴定。酶脱细胞方法制备人脱细胞羊膜（Human acellular amniotic membrane,HAAM）;苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）观察人羊膜组织及HAAM结构。将h AMSCs种植在HAAM上制备“仿生羊膜生物模型。人子宫内膜组织分离获取人子宫内膜间质细胞（Human endometrial stromal cells,h ESCs）,免疫组化法鉴定波形蛋白（Vimentin）及角蛋白（Cytokeratin）的表达情况。A组:“仿生羊膜与h ESCs通过Transwell分别共培养3天、8天。B组:“仿生羊膜单独培养8天。C组:h ESCs单独培养8天。激光共聚焦观察Vimentin、Cytokeratin的表达情况;实时荧光定量PCR检测A、B、C组的Vimentin、CK18及CK19的m RNA的表达情况。P0.05表示差异具有统计学差异。结果:成功获取h AMSCs,流式细胞学表型鉴定高表达CD105（98.4%）、CD29（98.2%）、CD44（99.2%）,低表达CD34（15%）及HLA-DR（4.2%）。免疫荧光显示h AMSCs表达Vimentin,不表达Cytokeratin。HE染色及扫描电镜见HAAM上细胞脱落干净,只留下各类胶原纤维。“仿生羊膜上,h AMSCs呈地毯式分布生长,发出细胞骨架与HAAM的各类粗细纤维紧密连接。分离获取h ESCs,免疫组化显示Vimentin表达阳性,Cytokeratin表达阴性。共培养后“仿生羊膜上细胞密度未见明显增长,细胞形态由扁平的长梭形,转变纺锤体状,外形与h ESCs相似。共培养后“仿生羊膜免疫荧光结果均表达Vimentin,不表达CK19。免疫荧光定量PCR显示:（1）共培养后“仿生羊膜与B组比较:CK19、CK18及Vimentin差异均有统计学意义（P0.05）,经过共培养后,“仿生羊膜上的h AMSCs没有向上皮方向转化,也未明显向子宫内膜间质样细胞（Endometrial stromal like cells,ESLCs）方向转化。（2）共培养3天与8天的“仿生羊膜比较:Vimentin差异有统计学意义（P0.05）,结合（1）对比,说明被诱导3天和8天后的“仿生羊膜上的h AMSCs保留间质细胞功能。（3）共培养后“仿生羊膜与C组比较:CK19及CK18差异均有统计学意义（P0.05）,经过共培养后,“仿生羊膜上的h AMSCs没有向上皮细胞方向转化;共培养3天后“仿生羊膜与C组比较:Vimentin差异有统计学意义（P0.05）,“仿生羊膜上的h AMSCs未明显向ESLCs方向转化;但共培养8天后“仿生羊膜与C组比较:Vimentin差异没有统计学意义（P0.05）,说明经过共培养8天后,“仿生羊膜上的h AMSCs成功向子宫内膜间质样细胞ESLCs转化。结论:1、hAMSCs可发出细胞骨架与HAAM发生连接,且这种连接不改变hAMSCs的干细胞特征,表明“仿生羊膜的理念是可行的。2、在Transwell共培养特定条件下,h ESCs可诱导“仿生羊膜上的h AMSCs定向转化为ESLCs,为“仿生羊膜用于医源性宫腔不孕的后续研究提供了实验依据。