NPM1及其磷酸化对中心体复制的影响

作     者：李俊颖 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：商维昊

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：NPM1 磷酸化 中心体 NPM3 代偿作用 

摘      要：目的:NPM1作为一种广泛存在于各种细胞内的核仁磷酸蛋白,主要参与核糖体的合成,近年来NPM1的其他功能也受到广泛关注,例如参与中心体的复制。早期研究表明,NPM1缺失可以导致小鼠胚胎成纤维细胞的中心体数目异常,并且NPM1纯合敲除可以导致小鼠胚胎死亡;然而,随着实验技术的不断发展,对中心体复合物进行蛋白组学分析鉴定,却并未鉴定出NPM1。因此,本研究对NPM1是否参与中心体的复制过程进行了探究。此外,NPM1作为一种高度磷酸化蛋白,具有很多磷酸化修饰位点,但其磷酸化修饰参与的生物学过程尚不明确。已有文献在野生型细胞中过表达NPM1,以说明NPM1磷酸化影响中心体复制过程,但尚不能阐明内源性NPM1是否参与或干扰该过程。因此,本研究采用NPM1细胞系,在更好的遗传学背景下探究NPM1磷酸化修饰是否影响中心体复制。本研究对NPM1是否参与中心体复制进行研究,并针对与前人不一致的结果作出假设,探究NPM1在中心体复制中的作用是否具有种属差异,以及NPM3是否对NPM1具有代偿作用。研究方法:在Jurkat E6-1 WT细胞中,通过CRISPR-Cas9技术敲除NPM1,构建NPM1细胞系,对中心体数目进行统计,探究NPM1是否参与中心体复制过程。通过阅读文献,选取NPM1磷酸化位点,构建该位点的点突变质粒,并将其转入Jurkat E6-1 WT和NPM1细胞系中,并对中心体数目进行统计,探究NPM1磷酸化对中心体复制的影响;进行流式检测,探究NPM1磷酸化对细胞周期的影响。使用si RNA对NPM3进行敲减,并对中心体数目进行统计,探究NPM3是否会代偿NPM1在中心体复制中的作用。结果:1、对NPM1和Jurkat E6-1 WT的中心体数目进行统计,二者间不存在统计学差异;2、在Jurkat E6-1 WT和NPM1中过表达NPM1和NPM1磷酸化位点突变质粒,观察到中心体数目变化:S4E-NPM1和S125A-NPM1会使含有三个及以上中心体的细胞数目异常增多,T199A-NPM1会使含有一个中心体的细胞数目增多;3、在Jurkat E6-1 WT和NPM1中过表达NPM1和NPM1磷酸化位点突变质粒,尚未观察到细胞周期的变化;4、敲低NPM1细胞系中NPM3的表达之后,发现中心体数目异常。结论:1、在本研究的特定细胞系(NPM1)中,尚不能说NPM1会影响中心体数目;2、NPM1的三个磷酸化位点S4、S125、T199都参与中心体的复制过程,其中S125和T199以磷酸化的形式参与中心体复制途径,而S4则以非磷酸化形式参与中心体的复制过程。在NPM1参与中心体复制的过程中,若S4磷酸化和S125非磷酸化会导致三个及以上中心体数目异常增多;而T199非磷酸化会导致中心体复制无法正常完成,一个中心体数目增多;3、NPM3可能在NPM1参与中心体复制的过程中发挥部分代偿作用。