鼠李糖乳杆菌B6代谢产物对氧化受损PC12细胞的保护作用及机制初探

作     者：李瑞盈 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：游春苹

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：益生菌 发酵代谢产物 神经细胞 抗氧化 

摘      要：氧化应激是由抗氧化防御系统与活性氧(ROS)之间的严重失衡引起的,最终将导致生物分子的过度氧化损伤。氧化应激是衰老和年龄相关疾病的基本原因之一。多项研究表明,乳酸菌、双歧杆菌等具有良好的抗氧化能力,能够使抗氧化酶活性得以提高,并对氧化应激起到调节和缓解的作用。当前国内外对乳酸菌代谢产物细胞层面抗氧化的研究成果较少。本课题探究了不同培养条件下鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)B6的体外抗氧化能力,再通过建立HO诱导的氧化损伤PC12细胞模型,研究B6发酵脱脂乳代谢产物对氧化受损PC12细胞的保护作用。首先,对实验室的4株乳杆菌进行体外抗氧化实验,以鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)作为对照菌株分别测定了发酵上清,活性菌体以及灭活菌体对于DPPH自由基、·OH、·O、ABTS的清除能力。研究结果表明鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)B6发酵MRS上清的抗氧化能力整体强于其它菌株,其DPPH自由基、·OH、·O、ABTS的清除能力分别可以达到63.23%±1.38%、99.38%±2.46%、26.35%±2.21%、18.33%±0.21%;并对不同培养条件下的B6发酵上清清除自由基能力进行测定,与B6发酵MRS上清相对B6发酵脱脂乳代谢产物可以将DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力分别提高到74.73%±2.99%、34.78%±2.60%。然后,在以HO作为诱导剂,成功建立氧化损伤PC12细胞模型的基础上,利用倒置显微镜呈现了细胞的形态变化,通过酶标仪得到了细胞氧化因子含量的变化,同时测定了细胞内抗氧化酶的活力。结果表明HO致使正常细胞皱缩,伪足消失,B6发酵脱脂乳代谢产物使氧化受损PC12细胞恢复了正常的细胞形态;同时B6发酵脱脂乳代谢产物能够降低氧化受损PC12细胞的ROS水平和MDA含量。其中15%浓度的B6发酵脱脂乳代谢产物效果较好,分别将SOD、CAT的活力提高到了模型组的1.76倍、3.18倍(P0.05),GSH含量也提高了0.71倍(P0.05)。其次,利用激光共聚焦显微镜以及流式细胞术检测方法,研究了B6发酵脱脂乳代谢产物对氧化受损PC12细胞凋亡的保护作用。实验结果显示B6发酵脱脂乳代谢产物减少了氧化应激对细胞核的氧化损伤、降低了细胞凋亡率、维持了线粒体膜的完整、平衡了细胞内外Ca的浓度,从而促进了细胞增殖,使细胞免受氧化损伤。其中15%浓度的B6发酵脱脂乳代谢产物能够将细胞凋亡率从模型组的15.99%±0.41%降至8.32%±0.30%(P0.05)。最后,分别从抗氧化、抗凋亡两个层面,对Keap-1/Nrf2信号通路和介导凋亡的线粒体通路中的相关基因m RNA表达水平进行测定,结果发现B6发酵脱脂乳代谢产物能够下调Keap-1 m RNA的表达水平,上调抗氧化相关基因的表达水平;同时Bax、Caspase-3 m RNA的表达水平降低,Bcl-2、PARP m RNA的表达水平提高。综上所述,B6发酵脱脂乳代谢产物具有良好的抗氧化特性,保护PC12细胞免受氧化损伤。B6发酵脱脂乳代谢产物不仅调节了Keap-1/Nrf2信号通路,也影响了介导凋亡的线粒体通路,通过调控两个通路中相关基因m RNA的表达量,从而激发了细胞内抗氧化酶的活性,抗氧化酶可将细胞内多余的自由基清除,解除细胞过度氧化应激,使细胞处于安全的抗氧化环境中,从而减少细胞凋亡。