鲢低氧胁迫下miRNA及其靶基因鉴定与分析
作者单位：上海海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：梁宏伟
授予年度：2022年
主 题：鲢 miRNA 高通量测序 低氧胁迫 双荧光素酶报告 组织表达
摘 要：鲢(Hypophthalmichthys molitrix)是我国重要的经济鱼类,在水产养殖业中具有重要地位,其在全国的淡水水域中有着广泛的自然分布,对于调节水域生态环境起到了积极作用。在鲢的人工养殖中,制约其产量提高的重要因素之一是低氧。低氧是鱼类养殖过程当中最严重的应激源之一,当水体氧含量过低会导致鱼类的生理或者机体方面发生变化,严重低氧甚至会导致鱼类直接死亡。micro RNA(miRNA)是一类单链小RNA,它与一般的编码RNA不同,不能编码蛋白质,其在动物和植物体内广泛存在,并在细胞发育、免疫应答以及某些基因的表达调控中起着十分关键的作用。本研究中,采集不同程度低氧胁迫下鲢的肝脏、脑、心脏以及鳃组织用以构建RNA混合池,通过Illumina Noveseq测序平台进行miRNA高通量测序,获得了不同低氧胁迫下鲢体内miRNA的表达情况以及miRNA的结构特征。对得到的miRNA在特定条件下进行筛选,分析其差异表达情况,利用荧光定量PCR(q PCR)进行鉴定,并对其靶基因进行预测与深入分析。采用双荧光素酶报告技术对差异表达的miR-17a-5p和预测到的靶基因进行关系鉴定,并对其在不同组织的表达水平进行探究。主要的研究结果如下:1、低氧胁迫下鲢miRNA测序为探究不同低氧胁迫下鲢体内miRNA的调控,使鲢在封闭水体中通过自然耗氧的方法,设置常氧组(T0)、浮头组(T1)、半窒息组(T2)和窒息组(T3)共四个试验组,采集肝脏、脑、心脏以及鳃组织,构建RNA混合池,进行小RNA高通量测序。结果显示,T0、T1、T2和T3分别获得26475225、26143905、22941194和28984723条原始序列(Raw read),对原始数据进行处理后分别获得25558042、25542062、19466537和28030238条有效序列(Clean read)。通过与mir Base(v22)数据库进行比对后,鉴定出鲢在不同低氧胁迫下的已知miRNA共299个,其中在T0、T1、T2和T3组分别获得已知miRNA 288个、286个、249个和280个。对鉴定出的miRNA进行碱基偏好性分析,发现A碱基和U碱基所占比例最多。使用mir Evo和miRdeep软件进行新miRNA(Novel miRNA)预测,共预测到391个新miRNA,T0、T1、T2和T3组分别获得305、279、165和298个。2、差异表达miRNA鉴定及靶基因分析通过edge R软件对获得的已知miRNA和新miRNA进行差异表达分析,将T0与T1,T0与T2,T0与T3,T1与T2,T1与T3和T2与T3进行两两比对,得到上调差异miRNAs个数分别为75、210、104、183、100和144个;得到下调差异miRNAs个数分别为55、112、60、152、95和186个。从每个对比组中随机挑选10个差异表达miRNA进行q PCR鉴定,q PCR获得的差异表达miRNA表达趋势与高通量测序结果基本相同,证明测序数据准确可靠。随后对这些差异表达miRNA使用Miranda和q Tar软件进行靶基因预测,并进一步对预测到的靶基因进行GO和KEGG富集分析,靶基因主要富集在信号转导(Signal transduction)、细胞生长和死亡(Cell growth and death)、免疫系统(Immune system)以及脂代谢(Lipid metabolism)等通路当中,表明差异表达miRNA的靶基因主要与鲢在低氧胁迫下的细胞凋亡、免疫以及能量代谢等方面有关。3、miR-17a-5p的靶基因验证与组织表达为深入探究差异表达miRNA与靶基因的作用关系,利用Mi Randa软件和q Tar软件对靶基因预测发现,miR-17a-5p与低氧诱导因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)存在靶向关系。利用双荧光素酶报告技术对二者的靶向关系进行验证,成功克隆野生型WT-pmir GLO-HIF-1α3′UTR和其突变型载体MUT-pmir GLO-HIF-1α3′UTR后,分别将其与miR-17a-5p的模拟物miR-17a-5p mimics以及阴性对照mimics NC转染至293T细胞,48h后进行荧光素酶活性检测发现,miR-17a-5p mimics与野生型载体的组合中荧光素酶活性显著下降(p0.05),而其他组合中荧光素酶活性并无明显变化,证实HIF-1α是miR-17a-5p的潜在靶基因。进而分析了miR-17a-5p在低氧胁迫下鲢的肝脏、心脏、脑和鳃中的表达特征,miR-17a-5p在鳃中的表达量高于其他三个组织(p0.05);而在不同低氧胁迫程度当中,浮头组和半窒息组中miR-17a-5p的表达水平显著高于常氧组和窒息组(p0.05)。
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