人参皂苷合成相关LncRNAs的鉴定与功能验证

作     者：吕博新 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张美萍

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：人参皂苷 长链非编码RNA 功能验证 生物信息学 遗传转化 

摘      要：人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科、人参属的多年生草本植物,是我国一味古老而名贵的中草药。人参皂苷是人参的主要活性成分之一,已经被证实有诸多药用价值。鉴定与验证在人参皂苷合成与调控中具有重要功能的基因,对于阐明人参皂苷的合成与调控机制及提高人参及其培养物中的皂苷含量至关重要。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)是一类长度不低于200个核苷酸,一般情况下无法编码蛋白的RNA类群。研究表明,Lnc RNA在真核生物的基因表达调控中具有十分重要的作用,但人参中有关Lnc RNA的研究较少,并且尚无调控人参皂苷合成重要Lnc RNA的功能验证研究。因此,本研究对吉林人参Lnc RNA进行了全面的筛选与分析,从中鉴定得到调控人参皂苷合成的重要Lnc RNA,并利用诱导子调控与农杆菌介导的遗传转化等方式对其调控人参单体皂苷合成的功能进行了验证,所得结果如下:(1)利用性质分析法与数据库比对法,从吉林人参转录组数据库中鉴定得到24,704条吉林人参Lnc RNA,构建为吉林人参Lnc RNA数据库;(2)对吉林人参Lnc RNA在42个农家品种中的表达量与相应人参皂苷含量进行相关性分析,鉴定得到与不同单体皂苷及总皂苷含量极显著相关(P-value1.0E-02)的Lnc RNA序列1,095条;(3)对以上Lnc RNA的SNP/In Dels突变与人参单体皂苷含量变化进行关联分析,得到25条Lnc RNA的57个SNP/In Dels突变与人参皂苷含量变化显著关联,推测这25条Lnc RNA可能对人参皂苷的合成具有重要的调控功能;(4)对以上25条与人参皂苷合成显著关联的Lnc RNA和17条已知的人参皂苷合成关键催化酶基因进行共表达heatmap分析与共表达互作网络network分析,鉴定得到多个与人参皂苷合成关键催化酶基因具有共表达趋势及显著共表达互作关系的吉林人参Lnc RNA,其中Pglnc14871与人参皂苷合成关键催化酶基因的共表达互作关系最为紧密,推测其在人参皂苷合成中具有重要调控功能,因此对Pglnc14871进行功能验证;(5)在茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)诱导不同时间的人参不定根转录组中,Pglnc14871的表达量相比于对照组极显著降低,且其表达量与多种人参单体皂苷和总皂苷的含量具有极显著负相关性,验证了Pglnc14871在Me JA诱导的人参皂苷合成过程中具有重要调控功能;(6)成功克隆吉林人参Pglnc14871与其反义RNA Anti Pglnc14871,并构建含有Pglnc14871-p CAMBIA3301与Anti Pglnc14871-p CAMBIA3301重组表达载体的发根农杆菌c58c1工程菌,利用农杆菌介导的遗传转化法获得过表达Pglnc14871的人参发状根无性系11个,反义表达Pglnc14871的人参发状根无性系1个;(7)检测反义表达Pglnc14871发状根无性系中的基因表达水平与皂苷含量,结果显示,Anti Pglnc14871与人参皂苷合成关键催化酶基因DS-1和DS-3的相对表达水平相比于对照组发状根显著升高,单体皂苷Rf与Rh1的含量相比于对照组发状根显著增加,说明Anti Pglnc14871对单体皂苷Rf与Rh1的合成具有显著促进功能,进一步验证了Pglnc14871在人参皂苷合成中具有显著调控功能。