m6A去甲基化酶FTO调节ULK1激活自噬调控胃癌顺铂耐药的研究

作     者：高灵犀 

作者单位：皖南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张妍

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃癌 顺铂耐药 FTO 自噬 ULK1 

摘      要：目的:通过细胞实验和移植瘤裸鼠模型,多层次研究mA m RNA甲基化修饰在胃癌顺铂耐药过程中的变化,探讨去甲基化转移酶FTO调控mA甲基化及自噬从而影响胃癌顺铂耐药的作用机制。方法:采用人胃黏膜上皮细胞GES-1、人胃腺癌细胞SGC-7901和顺铂耐药细胞株SGC-7901/DDP作为研究对象。(1)CCK-8法比较SGC-7901细胞和SGC-7901/DDP细胞的顺铂敏感性。然后对上述三种细胞进行m RNA mA的定量分析,免疫印迹法比较三者甲基化转移酶和去甲基化酶的表达水平。(2)CCK-8检测敲低FTO SGC-7901/DDP细胞和过表达FTO SGC-7901细胞的活力及对顺铂治疗的敏感性。透射电镜、免疫印迹、免疫荧光等手段检测敲低FTO SGC-7901/DDP细胞和过表达FTO SGC-7901细胞的自噬活性。(3)用3-MA和CQ下调SGC-7901/DDP细胞的自噬活性,然后CCK-8检测抑制自噬后SGC-7901/DDP细胞的顺铂抵抗性。(4)q RT-PCR测定转染sh FTO SGC-7901/DDP细胞的自噬相关基因m RNA含量。然后在敲低FTO SGC-7901/DDP细胞和过表达FTO SGC-7901细胞中用免疫印迹法检测ULK1蛋白水平。(5)免疫印迹检测转染si ULK1 SGC-7901/DDP细胞的下游自噬标志蛋白的表达,以及CCK-8检测敲低ULK1对SGC-7901/DDP细胞的顺铂耐药性的影响。(6)用q RT-PCR、免疫荧光和免疫印迹法检测过表达FTO SGC-7901/DDP细胞和过表达FTO同时敲减ULK1 SGC-7901/DDP细胞的自噬活性,CCK8比较两者顺铂耐药性。(7)Me RIP-q PCR检测转染sh FTO SGC-7901/DDP细胞中ULK1 m RNA的mA水平。RIP-q PCR检测转染FTO质粒的SGC-7901/DDP细胞中ULK1的富集情况。(8)在SGC-7901/DDP细胞中敲低YTHDF2,然后免疫印迹检测ULK1蛋白水平,RIP-q PCR检测ULK1的富集情况,q RT-PCR分析敲低YTHDF2对ULK1 m RNA稳定性的影响。然后在SGC-7901/DDP细胞中敲低YTHDF2或同时敲低FTO和YTHDF2,免疫印迹检测ULK1及下游自噬标记蛋白的表达,CCK-8检测两者对顺铂治疗的抵抗性。(9)构造转染sh FTO SGC-7901/DDP细胞裸鼠移植瘤模型,检测移植瘤的顺铂治疗效果,增殖情况及自噬活性。结果:(1)SGC-7901/DDP细胞具有明显的顺铂耐药性。m RNA mA含量在SGC-7901/DDP细胞中最低。FTO蛋白表达在胃癌细胞中升高,尤其是在SGC-7901/DDP细胞中。(2)在SGC-7901/DDP细胞中敲低FTO或在SGC-7901细胞中过表达FTO均对细胞活力无明显影响。然而敲低FTO可显著降低SGC-7901/DDP细胞的顺铂耐药性,抑制其自噬活性;过表达FTO明显提升SGC-7901细胞的顺铂抵抗性,增强其自噬活性。(3)3-MA或CQ抑制SGC-7901/DDP细胞的自噬活性后,其顺铂耐药性明显下降。(4)转染sh FTO SGC-7901/DDP细胞中自噬相关基因ULK1 m RNA含量减少,蛋白水平下降;在SGC-7901细胞中过表达FTO,ULK1表达随之升高。(5)敲低ULK1后SGC-7901/DDP细胞的LC3II表达减少,p62表达增高,顺铂耐药性显著下降。(6)过表达FTO同时敲低ULK1能逆转过表达FTO造成的自噬活性上升,以及逆转顺铂耐药性的升高。(7)敲低FTO引起SGC-7901/DDP细胞的ULK1m RNA mA水平升高。RIP-q PCR显示ULK1是FTO的直接靶点。(8)敲低YTHDF2使SGC-7901/DDP细胞的ULK1 m RNA稳定性增强,蛋白水平上升。RIP-q PCR显示YTHDF2对ULK1 m RNA有直接作用关系。同时敲低FTO和YTHDF2能逆转敲低FTO引起的SGC-7901/DDP细胞的自噬活性降低,以及逆转顺铂耐药性的下调。(9)在体内实验中,FTO的缺乏可明显减慢胃癌细胞的生长速率,并显著敏化SGC-7901/DDP对顺铂治疗的反应。我们在移植瘤中检测了自噬相关蛋白的表达。与体外研究一致,敲低FTO降低了ULK1的蛋白水平,自噬活性下降。结论:FTO表达升高引起ULK1基因的mA修饰减少,影响YTHDF2对其的降解,从而上调ULK1水平,促进自噬,并诱导胃癌细胞顺铂耐药。