海洛因依赖大鼠mPFC神经营养因子表达及胶质细胞反应研究

作     者：李莎 

作者单位：皖南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：朱再满

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100205[医学-精神病与精神卫生学] 10[医学] 

主      题：海洛因 条件位置偏爱 内侧前额叶皮层 神经营养因子 神经胶质细胞 

摘      要：目的:建立大鼠海洛因诱导条件性位置偏爱（CPP）模型,运用行为学、形态学和分子生物学等实验方法,检测大鼠内侧前额叶皮层边缘前区（PL）和下边缘皮层（IL）神经营养因子表达及胶质细胞反应水平,探索其在海洛因依赖进程中的作用和相关机制。方法:1.建立海洛因诱导CPP模型:实验大鼠随机分为生理盐水处理的对照组和海洛因处理的诱导组。利用CPP系统,小剂量递增法建立大鼠海洛因诱导CPP模型。上午诱导组大鼠皮下注射海洛因,白箱中训练45 min,下午注射等量生理盐水,黑箱中训练45 min,起始剂量0.5 mg/kg,连续7 d,每天以0.5 mg/kg的剂量递增。对照组大鼠用等量生理盐水代替海洛因,训练方法同上。训练结束后次日行CPP测试,记录所有大鼠的各项行为学参数及运动轨迹,依据大鼠海洛因给药前后各项行为学参数变化情况来判断海洛因诱导CPP模型是否建立成功。CPP模型建成后,海洛因诱导组被分为海洛因诱导CPP状态和戒断状态。戒断状态大鼠停止给药并自然戒断7 d,再行CPP测试,记录相关行为学数据。2.检测PL区、IL区BDNF和GDNF的表达水平:从海洛因诱导CPP造模成功大鼠中,每组随机抽取,大鼠心脏灌流处死,取脑,制作冠状冰冻切片（厚20μm）;另取大鼠断头处死,参照大鼠脑立体定位图谱,取出PL区和IL区置于离心管中,-80℃超低温冰箱保存。采用免疫荧光组织化学染色及Western Bolt方法,检测PL区、IL区BDNF和GDNF的表达,比较对照组、海洛因依赖及戒断状态下的差异。3.观察PL区、IL区星形胶质细胞和小胶质细胞的胶质反应变化:从海洛因诱导CPP造模成功大鼠中,每组随机抽取,大鼠心脏灌流处死,取脑,制作冠状冰冻切片（厚20μm）,采用免疫组织化学法,观察PL区、IL区星形胶质细胞和小胶质细胞的胶质反应,比较对照组、海洛因依赖及戒断状态下的反应变化。结果:1.大鼠经过7 d海洛因诱导CPP训练后,诱导组大鼠在白箱活动时间百分比与白箱活动路程百分比均较给药前显著增加（P0.05）,提示海洛因诱导CPP模型建立成功。对照组给生理盐水前后,其行为学数据无显著差异（P0.05）,提示生理盐水无法诱导CPP产生。海洛因戒断状态大鼠在白箱活动时间百分比、活动路程百分比、黑白箱内总路程及穿梭次数与海洛因CPP状态和对照组相比均显著增加（P0.05）,提示海洛因戒断状态大鼠有明显的觅药行为。2.大鼠脑片免疫荧光组织化学染色显示,对照组、CPP状态和戒断状态大鼠PL区和IL区均有BDNF和GDNF表达。Western Bolt结果显示,大鼠BDNF蛋白表达水平在PL区表现为从对照组、CPP状态到戒断状态梯度性升高,且都有显著性差异（P0.05）;IL区表现为CPP状态表达量最高,戒断状态低于CPP状态（P0.05）,但明显高于对照组（P0.05）。GDNF蛋白表达量在PL区表现趋势同BDNF;IL区呈现CPP状态表达量最低,戒断状态相对于CPP状态有所增高（P0.05）,但明显低于对照组（P0.05）。3.大鼠脑片免疫组织化学染色显示,海洛因CPP状态大鼠与对照组大鼠相比,PL区、IL区星形胶质细胞的特异性标志物GFAP以及小胶质细胞的特异性标志物Iba 1表达均显著增强（P0.05）,免疫反应性胶质细胞表现出明显的增生性变化。戒断7 d后,戒断状态大鼠PL区、IL区GFAP和Iba 1持续高表达,细胞仍保持增生性变化。结论:本研究利用CPP系统成功建立海洛因依赖大鼠模型,大鼠白箱活动时间百分比、白箱活动路程百分比均较给药前增加,戒断后大鼠位置偏爱表现更加显著。在海洛因诱导CPP形成及消退阶段,BDNF和GDNF在PL区、IL区具有差异性的表达变化。海洛因诱导CPP形成及戒断状态下,PL区、IL区内星形胶质细胞和小胶质细胞均表现出明显的增生性变化,特异性标志物GFAP和Iba 1表达均增加,提示海洛因诱导CPP进程中PL区、IL区内星形胶质细胞和小胶质细胞均能被激活。