大蓟干预KatG酶对结核杆菌生命特征的影响

作     者：刘春秀 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨再昌

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：KatG酶 结核杆菌 作用机制 结构修饰 

摘      要：结核病(Tuberculosis,TB)是由于感染结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB)引起的传染病。尽管有抗结核药物治疗结核病,但随着耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)的结核分枝杆菌菌株引起的结核病广泛流行,导致结核病的防治形势十分严峻,因此有必要不断发现具有新作用机制的抗结核分枝杆菌分子。本论文从大蓟根中分离到总生物碱,进一步分段,得到具有抗结核杆菌活性的3个生物碱组分,MIC值在40-80μg/m L之间;经LC-MS分析,在组分2中发现喹啉类生物碱。为获得活性更强的分子,基于分子拼合原理将喹啉类、异喹啉类生物碱与氨基硫脲进行缩合反应,得到7个化合物(MIC=2-8μg/m L),采用软件进行成药性及药代动力学预测,7个化合物均显示具有较好的成药性和较理想的药代动力学特征。本课题组在前期研究中,从大蓟分离到槲皮素,该化合物通过抑制结核杆菌Kat G酶发挥抗菌活性。为揭示所合成的7个化合物的作用机制,首先进行分子对接研究,结果表明化合物都能与Kat G酶活性中心的氨基酸残基形成牢固结合。由于化合物5的抗结核杆菌活性最强,然后研究化合物5对Kat G酶的抑制作用,结果提示化合物5能够抑制结核杆菌Kat G酶,呈明显的量效关系。继续采用荧光定量PCR测定化合物5对结核杆菌Kat G酶转录的影响,结果显示化合物5(2μg/m L)可以引起kat G基因转录的上调,这可能是结核杆菌对细胞内过氧化氢过度积累的一种负反馈调控机制。此外,发现随着化合物5浓度的不断提高,结核杆菌细胞内氧自由基浓度相应增加。显微成像技术显示,结核杆菌被化合物5干预后,形态发生了明显变化,我们推测,Kat G受到抑制后,结核杆菌不能正常分解过氧化氢,使胞内氧自由基增多,大分子结构受到破坏,使结核杆菌不能维持正常形态。因此,化合物5的作用靶点可能是结核杆菌Kat G酶。本论文还合成了其它一些非喹啉类化合物,活性普遍较低,从而验证喹啉和异喹啉可作为合成抗结核杆菌分子的基本骨架。此外,测定并比较了大肠杆菌、结核杆菌、人血红细胞Kat G酶分解过氧化氢的米氏常数(K),发现结核杆菌K(0.474)大肠杆菌K(0.3795)人血红细胞K(0.209),为进一步研发结核杆菌Kat G酶选择性抑制剂奠定了基础。综上,大蓟的喹啉生物碱是抗结核杆菌的活性组分之一;喹啉、异喹啉可作为基本骨架合成新型抗结核杆菌分子;化合物5通过抑制结核杆菌的Kat G酶产生抗菌作用,进一步进行结构优化可能得到具有新作用机制的先导物;结核杆菌Kat G酶与其它物种的Kat G酶存在活性差异,为研发高选择性分子提供了依据。