利用iPS技术构建类脑器官模型以探索神经发育中的表观遗传机制

作     者：黄俊驹 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈捷凯

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：孤独症 CHD8 重编程 诱导多能干细胞(iPSCs) 外周血单核细胞(PBMC) 类脑器官 基因编辑 单细胞测序 

摘      要：研究背景:神经发育受到表观遗传与基因的精细时空调控。神经发育障碍病人大规模基因组研究表明表观遗传信息的改变与疾病高度相关。因而,采用有效模型来揭示神经发育表观遗传调控机制是研究的突破口。研究目的:本研究旨在利用iPS与类脑器官技术联合多组学分析,通过致病表观遗传基因KMT2D与CHD8,分别探究神经发育障碍KABUKI综合征与孤独症的表观遗传机制。研究方法:我们首先通过重编程技术诱导病人家系iPSCs,通过q PCR,免疫荧光以及拟胚体实验等方法进行细胞验证,然后使用基因编辑对人ESC或iPSC进行疾病基因型模拟,再诱导制备类脑器官,通过qPCR,免疫荧光以及多组学分析等手段对类脑器官体系进行验证,通过这一套体系,我们可以深入研究单个或多个基因缺陷在神经发育过程中的表观遗传调控机制。各章节研究结果:文章主要围绕KMT2D分子机制与CHD8孤独症类脑器官建立两个部分进行。第一部分,我们构建歌舞伎综合征类脑器官模型进行组蛋白H3K4甲基转移酶KMT2D的致病机制的探究。前期研究中,实验室在人胚胎干细胞系HN4中通过CRISPR-Cas9基因敲除KMT2D SET结构域,构建KMT2D SET细胞并诱导类脑器官,通过免疫荧光与RNA-seq发现KMT2D的敲除引起WNT信号配体表达下降以及GABAergic interneuron的过量产生。为了探究KMT2D是否通过WNT通路影响GABAergic interneuron的分化,我们利用WNT激动剂在KMT2D SET类脑器官中激活WNT通路,发现GABAergic interneuron的过量产生的现象得到挽救;利用WNT抑制剂IWP发现能使野生型细胞GABAergic interneuron的过量产生。这些结果为后续研究发现KMT2D靶标Roof plate的WNT增强子提供了依据与思路,从而为KABUKI综合征提供了新见解。第二部分,我们拟采用第一部分的研究范式,研究孤独症基因CHD8在类脑器官中的作用机制。孤独症谱系障碍是一类神经发育疾病,其主要表现为神经系统失调影响到大脑功能而导致的终身发展障碍。染色质域-解旋酶-DNA结合蛋白8(CHD8)是孤独症的高危基因之一。我们与合作医院进行临床病例分析,采集CHD8家系的血液样本分离外周血单核细胞(PBMCs),目前已运用iPS重编程技术,取得了患者及其亲本PBMCs重编程的iPSCs。得到了病人及亲本的iPSCs后我对其进行了验证,通过q PCR和免疫荧光检测其多能性基因的表达;制备拟胚体进行分化潜能检测;确定了两株细胞可用后,我们进行了类脑器官体系构建的摸索,并成功制备了类脑器官,通过观察形态及检测神经相关标志基因,我们确立了初步的类脑器官制备体系。随后,我运用CRISPR-Cas9-ss ODN基因编辑技术对患者iPSCs突变位点进行修复。通过制备EB检测其分化潜能,发现其向外胚层及内胚层分化能力存在缺陷,通过核型检测,发现其存在平衡易位现象。接下来,我们拟结合单细胞测序技术,破译CHD8引起的发育时空轨迹中表观调控异常及机制。另外,我通过iPSCs重编程技术验证了实验室自主开发的i CD1培养基的优越性,通过该系统产生的iPSCs在克隆形态、细胞功能、细胞标记物和转录组方面与胚胎干细胞几乎一致,因此适合用于下游生物学研究。我们的方法能够简单使用地制备小鼠iPSCs,为进一步改进iPSCs技术提供了起点。研究结论:本论文通过从iPSC重编程到类脑器官模型建立来探究神经发育疾病的表观机制,发现KMT2D通过WNT信号通路调控GABAergic interneuron过度表达。此外还构建了CHD8类脑器官模型。这些研究将为神经发育障碍致病的机理研究提供了新的研究思路及范式。