邻苯二甲酸二异丁酯靶向结合TMEM16A上的K384和K428位点抑制结肠癌细胞增殖的研究

作     者：魏立军 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖庆桓;姚凡

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：TMEM16A 邻苯二甲酸二异丁酯 结合位点 结肠癌 

摘      要：目的:TMEM16A,又称ANO1,属于TMEM16家族,包含十个跨膜的α-螺旋和一个细胞外成分。TMEM16A参与调节多种细胞功能,如调节分泌性上皮细胞的Cl分泌、平滑肌的收缩和痛觉、肿瘤细胞的增殖和迁移等。此外,在癌症的发生发展过程中常伴随着TMEM16A的异常上调。邻苯二甲酸二异丁酯是常见的邻苯二甲酸盐之一。本课题组发现,在全细胞记录模式下邻苯二甲酸二异丁酯对TMEM16A存在抑制作用,但是邻苯二甲酸二异丁酯结合TMEM16A的关键位点尚不明确,并且邻苯二甲酸二异丁酯对肿瘤细胞的增殖影响也还不清楚,为此本研究运用膜片钳Whole-cell记录模式,探究邻苯二甲酸二异丁酯结合TMEM16A的相关作用和靶向TMEM16A对结肠癌细胞SW620增殖作用的影响。实验方法:1、利用感受态细胞转化和提取野生型过表达TMEM16A质粒DNA,运用MOE分子对接预测R605、R621、R788、K384、K428等相关位点,并进行定点突变,得到突变体质粒。将野生型质粒和突变型质粒瞬时转染至HEK293细胞上,依靠膜片钳Whole-cell记录模式,在180n M钙浓度条件下,进行细胞外给药,记录邻苯二甲酸二异丁酯分别对野生型、突变型TMEM16A钙激活氯电流的影响。2.通过CCK-8检测30μM浓度下邻苯二甲酸二异丁酯对SW620细胞的抑制作用。利用CCK-8检测30μM浓度下邻苯二甲酸二异丁酯对转染了Scrambled TMEM16A sh RNA和转染了TMEM16A-sh RNA蛋白的SW620细胞增殖的抑制作用。实验结果:1.在Whole-cell记录模式下邻苯二甲酸二异丁酯抑制转染野生型TMEM16A质粒成浓度依赖性,其IC值为8.03μM。邻苯二甲酸二异丁酯对两种突变体K384A和K428A钙激活氯电流的抑制作用显著减小,在10μM药物浓度下抑制率为野生型两种单点突变型双突变型,依次为60.24%(野生型)、35.28%(K428A)、29.44%(K384A)、16.28%(K384A-K428A)。2.CCK-8结果显示30μM浓度下邻苯二甲酸二异丁酯能够抑制SW620细胞增殖,处理48h后抑制率为44.48%,并且与Scrambled TMEM16A sh RNA相比,邻苯二甲酸二异丁酯对转染TMEM16A-sh RNA的SW620细胞增殖的抑制作用明显减弱。实验结论:1.邻苯二甲酸二异丁酯抑制TMEM16A钙激活氯电流;2.K384、K428是邻苯二甲酸二异丁酯抑制TMEM16A的关键氨基酸;3.邻苯二甲酸二异丁酯靶向结合TMEM16A抑制结肠癌细胞增殖。