毕赤酵母组成型高效分泌合成猪肌红蛋白

作     者：张博涵 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李江华

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：食品级的猪肌红蛋白 血红素 毕赤酵母 流加发酵 蛋白纯化 

摘      要：肌红蛋白(Myoglobin,Mb)是一种由血红素辅基和珠蛋白构成的血红素蛋白,与肉的颜色和风味密切相关,可作为人造肉的颜色及风味添加剂。肌红蛋白的生产方法有提取法与微生物合成法。提取法昂贵且耗时,难以得到高纯度的肌红蛋白;而之前的微生物合成法所得肌红蛋白产量较低无法满足商业化生产需求。本研究以Pichia pastoris X33为宿主菌株,实现了重组猪肌红蛋白的组成型分泌表达。在此基础上,对P.pastoris X33-Mb菌株分别进行摇瓶和发酵罐水平的发酵优化,并引入了GAP增强型启动子G1,确定了P.pastoris X33-Mb及P.pastoris X33-G1-Mb菌株的发酵工艺。最后,开发了一种食品级的猪肌红蛋白纯化方法并实现了纯化样品中血红素含量的定量分析。主要内容及结论如下:(1)为确定合适的宿主菌株,本研究以P.pastoris X33、GS115、KM71、SMD1168为宿主对猪肌红蛋白进行表达,其中P.pastoris X33与KM71成功实现了猪肌红蛋白的组成型分泌表达。结果表明,P.pastoris X33为表达猪肌红蛋白的最佳宿主菌株。引入了9种不同的信号肽,其中仅有α-factor、HSA、SP23信号肽可分泌猪肌红蛋白,最佳分泌信号肽为原始信号肽α-factor。(2)为初步确定发酵条件与发酵工艺,在摇瓶水平对培养基种类、C源、N源、发酵温度、氯化血红素添加浓度进行发酵优化。最终确定的发酵条件为:10 g·L酵母粉、20 g·L胰蛋白胨、10 g·L甘油、4×10 g·L生物素及40 mg·L血红素,产量最高为10.62 mg·L;在优化后的条件下对P.pastoris X33-G1-Mb(GAP增强型启动子G1)菌株进行摇瓶水平的发酵,产量最高可达17.20 mg·L。(3)为了扩大发酵规模,继续在发酵罐水平对发酵时间、DO控制水平、氯化血红素补加浓度和种类、发酵培养基进行了优化。P.pastoris X33-Mb在发酵罐水平确定的发酵工艺为:30%DO-stat反馈控制策略,工业级血红素补料浓度为150 mg·L。经84 h的发酵,改良BMGY培养基与BSM培养基的最高产量分别可达255.95 mg·L、409.70mg·L。P.pastoris X33-G1-Mb的发酵工艺与P.pastoris X33-Mb相同,改良BMGY培养基与BSM培养基对应的最高产量分别可达285.42 mg·L、576.42 mg·L。(4)为制备出食品级的猪肌红蛋白,最终确定的纯化工艺为超滤浓缩-阴离子交换(重力层析柱),该方法所纯化出的猪肌红蛋白纯度为88.04%,回收率为66.05%。采用不同的方法对纯化后所得猪肌红蛋白的血红素含量进行定量分析,经验证后最终确定的方法为酸性丙酮法。经检测,纯化所得猪肌红蛋白结合血红素的最高含量为0.22(mol heme)·(mol Mb)。