细胞穿膜肽OpiCalcin1的合成及其穿膜活性评价

作     者：陈建美 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张晶;肖良

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：蝎毒素 OpiCalcin1 穿膜肽 固相合成法 药物载体 

摘      要：蝎子又称为全蝎,为治风要药,具有驱风,镇惊及攻毒之功效,蝎子的药用价值主要在它的药理毒素成分。蝎毒中的活性成分主要由蛋白质成分和非蛋白质成分两部分组成,其中非蛋白质成分中主要含有粘多糖、组织胺、5-羟色胺、有机酸及微量元素等,而发挥主要功能作用的蛋白质成分则主要由小分子多肽组成,这些小分子多肽通常被称为蝎毒素,它们往往由20～80个氨基酸组成,在组成蝎毒素的这些氨基酸中又含有数个半胱氨酸,半胱氨酸可相互作用形成多个二硫键,这种结构可以发挥蝎毒多肽的生物功能以及提高其稳定性。目前所发现的蝎毒多肽已有300种,这些蝎毒多肽为离子通道抑制剂,其具有抗癫痫、抗血栓、抗肿瘤、镇痛等生物活性,除此以外,蝎毒多肽还具有细胞穿膜肽所具有的一些特征,可以作为新型的药物载体发挥其功能。在本次研究中我们以多肽Opi Calcin1为研究对象对其进行穿膜活性研究,Opi Calcin1是一类从蝎毒中分离得到的肽类毒素,该毒素多肽由33的氨基酸组成的短肽,具有很好的抗心律失常活性及穿膜活性。因此,本文围绕蝎毒素Opi Calcin1进行合成、纯化以及穿膜活性分析,以在之前的研究基础上进行进一步的功能探究,以将蝎毒素Opi Calcin1进行老药新用,发挥其新的药用价值。主要研究内容如下:1、根据序列长度对Opi1进行分片段合成。Opi Calcin1序列一共由33个氨基酸组成,具有明显的穿膜功能,因此,我们对Opi Calcin1中发挥功能的片段进行确定并对其穿膜活性进行分析。(1)首先将Opi Calcin1拆分为5个序列片段并进行分析,即:Opi1 1～16GDCLPHLKRCKENNDC、Opi1 17～33 CSKKCKRRGTNPEKRCR、Opi1 1～11GDCLPHLKRCK、Opi1 12～22 ENNDCCSKKCK、Opi1 23～33 RRGTNPEKRCR。(2)在明确Opi1多肽序列之后,采用Fmoc固相合成对上述五条多肽进行化学合成合成,并选用wang-resin作为固相载体,对合成的肽链进行固定,然后按照序列顺序对依次将氨基酸进行连接。(3)氨基酸连接完成后,用异硫氰酸荧光素(FITC)对其进行荧光标记,以追踪各个多肽片段在细胞中的穿膜效果。(4)多肽粗品合成完成后用冰乙醚进行沉淀析出,然后用分析型HPLC及制备型HPLC对粗品多肽进行分析及纯化,用ESI-MS对得到的多肽进行鉴定。最后,通过纯化及分析得到了FITC-Opi1 1～16,纯度为97.071%;FITC-Opi117～33,纯度为95.872%;FITC-Opi1 1～11,纯度为99.586%;FITC-Opi1 12～22,纯度为96.668%;FITC-Opi1 23～33,纯度为91.655%。2、根据碱性氨基酸片段的分布情况对Opi Calcin1进行划分。组成Opi Calcin1的33个氨基酸中分布有三个碱性氨基酸片段,分别为Opi1 3～11 CLPHLKRCK、Opi1 16～24CCSKKCKRR、Opi1 25～33 GTNPEKRCR。选用Fmoc固相合成法对以上三个片段进行合成,并依然用FITC对其进行标记,用分析型HPLC及制备型HPLC对其纯化后,用于探究其穿膜效果。另外,选用细胞穿膜肽TAT作为阳性对照,根据TAT的序列结构对其进行化学合成,用于Opi Calcin1系列细胞穿膜肽的穿膜活性比较。最后,通过分析纯化得到了FITC-TAT,纯度为99.204%;FITC-Opi1 3～11,纯度为99.586%;FITC-Opi1 16～24,纯度是96.370%;FITC-Opi1 25～33,纯度是92.106%。3、Opi Calcin1系列穿膜肽的透膜活性及细胞毒性分析。以细胞穿膜肽TAT为阳性对照,对合成的Opi1系列穿膜肽进行穿膜活性分析。在10μM多肽浓度下,对HEK 293T细胞进行孵育两个小时,探究其穿膜效果,流式细胞术结果显示,Opi1 17～33以及Opi123～33的细胞穿膜肽的穿膜效果较好,细胞内平均荧光强度要远远高于阳性对照肽TAT。接着,对TAT、Opi1 1～16、Opi1 17～33、Opi1 1～11、Opi1 12～22、Opi1 23～33、Opi1 3～11、Opi1 16～24、Opi1 25～33这九条多肽进行细胞毒性分析。结果表明,TAT、Opi1 1～16、Opi117～33、Opi1 1～11细胞毒性较小,尤其是多肽Opi1 17～33不但穿膜效果高于TAT,而且细胞毒性也远小于TAT,因此,蝎毒素Opi1 17～33有望成为一种新型的细胞穿膜肽。本研究通过化学合成法合成了蝎毒素Opi Calcin1,并用异硫氰酸荧光素对其进行荧光标记,探究了蝎毒素Opi1系列穿膜肽的穿膜效果,在于TAT进行比对后发现了一种穿膜效果更好且毒性更小的细胞穿膜肽Opi1 17～33,此细胞穿膜肽有望成为一种新型的细胞穿膜肽,为药物载体提供一种新的选择。