苹果蠹蛾精巢特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（TSSKs）功能研究

作     者：魏子涵 

作者单位：沈阳农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨雪清

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：苹果蠹蛾 昆虫不育技术 精巢特异性表达基因 RNAi CRISPR/Cas9 

摘      要：苹果蠹蛾Cydia pomonella是我国重大农业入侵害虫,严重威胁黄土高原和环渤海湾苹果优势产区的水果生产安全,被农业农村部列入《一类农作物病虫害名录》。在全球几乎所有的苹果产地,对苹果蠹蛾的防治主要依赖化学杀虫剂。然而,杀虫剂的过度使用导致苹果蠹蛾对60余种杀虫剂产生了抗性。昆虫不育技术(Sterile insect technique,SIT)是一种环境友好型的害虫防治技术,主要通过物理辐照、化学处理、遗传修饰等方式对靶标害虫处理使其不育,然后大量、持续释放到害虫发生区,通过与野生雌虫交配产生不育后代,从而达到降低种群数量和控制害虫的目的。基于RNA干扰(RNAi)和基因编辑等分子生物学技术对精巢特异性表达的且与生殖相关基因进行调控,是昆虫不育技术的新思路。本研究利用转录组测序技术对苹果蠹蛾雄成虫精巢特异性表达基因进行鉴定,通过RNAi及CRISPR/Cas9技术确定基因功能,为利用遗传修饰的SIT技术防控苹果蠹蛾提供靶标基因。主要结果为:1.苹果蠹蛾精巢发育动态通过解剖苹果蠹蛾不同日龄的幼虫、蛹和成虫精巢,发现苹果蠹蛾5龄幼虫含有两个独立的肾形精巢,分为4室;两个精巢在预蛹期逐渐靠拢,在蛹期融合为一个黄色近圆形精巢;随着精巢的发育,输精管逐渐形成,并在成虫期发育成熟,呈红褐色;交配后,精巢变瘪,颜色变浅。2.苹果蠹蛾精巢转录组转录组测序结果显示,在2日龄(未交配)和5日龄(已交配)雄成虫精巢中特异性上调表达基因分别为7824条和6989条。进一步分析发现,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Testis-Specific Serine/Threonine Kinases,TSSKs)、细胞周期蛋白基因(Cyclin)、Tektin基因均在苹果蠹蛾2日龄和5日龄精巢组织高表达;其中,5条TSSKs基因(TSSK1、TSSK1a、TSSK2、TSSK2a和TSSK4)在精巢高表达(logFold Change均大于7.57)。RT-q PCR分析结果表明,TSSKs基因在幼虫期呈现出随龄期升高表达水平上升的趋势,在5龄幼虫中的表达水平显著高于幼虫的其它龄期;TSSKs家族基因的表达水平在成虫期达到最高,且在雄虫(蛹、成虫)中显著高于雌虫。在这5个基因中,TSSK4的表达量显著高于其它基因,而TSSK1和TSSK2a在交配后成虫精巢中的表达量显著低于交配前。3.苹果蠹蛾TSSKs基因RNAi基于基因表达模式结果,采用蛹期-成虫期连续注射ds RNA的方式进行RNAi,分析TSSK1a、TSSK2和TSSK4基因与苹果蠹蛾生殖功能的关系。结果表明,与对照(ds GFP)相比,成虫注射ds TSSK2、ds TSSK1a和ds TSSK4 48 h后,TSSK2、TSSK1a和TSSK4基因的干扰效率分别为86.09%、42.67%和75.62%。,与雌蛾交配后所产的卵孵化率分别为0%、24.12%和0%。在处理72 h后,TSSK4基因的干扰效率为24.57%,但TSSK1a和TSSK2基因没有被有效干扰。4.苹果蠹蛾基因编辑体系构建利用CRISPR/Cas9技术,敲除苹果蠹蛾TSSK1基因,并建立了TSSK1基因缺失13个碱基的纯合突变体,基因编辑效率4.35%,但没有获得可育后代。该基因在苹果蠹蛾生殖中的功能有待进一步确定。