基于质谱联用技术探讨知母炮制机理

作     者：未金焕 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜英峰

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：知母 炮制机理 知母皂苷AⅢ 挥发油 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 

摘      要：目的:为了比较知母炮制前后化学成分的变化和差异,建立基于质谱联用技术对知母炮制前后皂苷类成分和挥发油类成分进行定性和定量分析方法,并结合植物代谢组学方法寻找差异化合物,采用分子对接技术初步评价知母炮制前后的降血糖活性的差异;另外,通过大鼠肠道菌群体外温孵实验研究知母皂苷AIII的代谢特征。方法:皂苷类成分定性定量分析:6批盐知母的制备参照《中国药典》(2020版,一部)方法,另取6批知母药材,分别以料液比2 g:20 m L(75%乙醇)进行超声提取1 h,温度为50℃;采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,梯度洗脱,在正负离子模式下分别检测,利用MRM模式对9种皂苷成分定量分析,利用全扫描采集模式对皂苷成分定性分析。定量数据经过Multi Quant软件处理分析;知母皂苷类成分定性则通过已有对照品裂解规律、自建知母皂苷库和在线数据库比对,借助Peak View软件进行鉴定,为了寻找知母炮制前后的差异性皂苷类成分,原始数据经过Progenesis QI预处理,导入SIMCA-p 14.1软件和Metabo Analyst 5.0网站进行统计分析设定筛选条件,与鉴定的皂苷类成分对应找出差异性皂苷类成分。采用分子对接技术评价皂苷类成分与α-葡萄糖苷酶的结合试验,初步从体外评价知母炮制前后降血糖作用的差异。挥发油成分的比较:采用水蒸气提取挥发油的方法提取挥发油,进行气质联用(GC-MS)分析。得到的原始数据与数据库NIST MS进行匹配鉴定知母和盐知母中所含的挥发油类成分,同时原始数据经过MS-DIAL 4.7软件处理,之后导入SIMCA-p 14.1软件和Metabo Analyst 5.0网站进行统计学分析并筛选出知母炮制前后的差异性挥发油类成分。知母皂苷AⅢ体外代谢物研究:收集健康大鼠的新鲜粪便建立肠道菌孵育体系,进行知母皂苷AIII肠道菌代谢试验,采用甲醇沉淀蛋白的方法处理生物样本。采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,在正离子模式下全扫描采集数据,将结果导入Molecule Profiler软件,依据母药裂解规律推断可能的代谢产物和代谢途径。结果:建立的9种皂苷类成分的液质联用的定量方法,经过全面的方法学考察,均符合要求,测定了知母和盐知母中9种皂苷化合物含量,其中知母皂苷元、知母皂苷AI、知母皂苷AIII、知母皂苷BIII、知母皂苷C在炮制后含量显著增加,知母皂苷E、知母皂苷I、知母皂苷BII、新知母皂苷BII在炮制后含量减少;在知母和盐知母中初步鉴定出63种皂苷类化合物,筛选出29种差异性皂苷类成分,其中16种差异化合物可以与α-葡萄糖苷酶进行良好的对接。GC-MS分析鉴定了知母和盐知母中50种挥发油类成分,主要包括酸类、醛类和酯类,筛选出13种差异性成分,差异性成分具有抗炎、抗菌和抗氧化的作用。在肠道菌孵育液中共发现知母皂苷AIII的13种代谢物,主要涉及的代谢途径包括脱糖反应、氧化反应、甲基化反应等。结论:本研究借助植物代谢组学结合质谱联用技术全面比较知母炮制前后体外物质基础及特征性化学成分,采用分子对接技术,以α-葡萄糖苷酶抑制率为评价指标,初步探究知母炮制前后降血糖药效差异,进而考察知母炮制前后体外物质变化与降血糖作用差异的相关性,阐明炮制后知母药效变化的体外物质基础。知母皂苷AIII作为主要活性成分,在体外代谢主要包括脱糖、去甲基和氧化途径,为进一步药理学研究和临床作用奠定基础,也为新药开发提供新的思路。