基于化学同位素标记液相色谱-质谱法测定辐照全血代谢谱

作     者：陆璇 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹红翠

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 100215[医学-康复医学与理疗学] 10[医学] 

主      题：辐照血 代谢组学 化学同位素标记 液相色谱-质谱法 

摘      要：背景与目的辐照血是临床上一种较新的血液制品,最常用的方法是使用照射强度为25-30Gy的γ射线对血液制剂进行照射,使血液制剂中的淋巴细胞失去增殖活性。辐照血主要应用于预防输血相关的移植物抗宿主病（TA-GVHD）。这是一种病死率高达90%以上的疾病,由于供体的血液中含有具有免疫活性的淋巴细胞,进入受体后可能在受体体内发生严重的免疫反应。日本、欧美等国家辐照血的应用开始较早,技术成熟;而我国辐照血使用尚未普及,对辐照血的认识相对不足。辐照可能会改变血液成分的代谢,从而影响血液质量,但目前对于辐照血的代谢研究多为描述性研究或局限于对血液中钾离子（K+）、三磷酸腺苷（ATP）等成分进行含量测定,对辐照后外周血中各组分,如红细胞、血浆和单个核细胞的代谢组学改变及意义缺乏系统性研究。本研究使用加拿大阿尔伯特大学（University of Albert）Liang Li教授团队建立的新一代高效化学同位素标记的色谱-质谱联用（CIL LC-MS）方法,测定辐照前后血浆、外周血单个核细胞（PBMC）和红细胞中代谢物的差异以及代谢途径的变化,为后续保存液配方的优化以及临床应用提供数据支持。方法收集健康人外周血进行血液辐照,检测辐照前后血液血常规的数值、K+水平以及ATP水平;使用细胞计数试剂盒（CCK-8）及流式细胞术检测辐照前后PBMC增殖能力以及凋亡的变化;使用CIL LC-MS的方法,利用12C/13C-丹酰化（DNS）分别标记血浆、红细胞、单个核细胞中含胺基/酚羟基的代谢物,使用主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行聚类分析,利用火山图、维恩图寻找差异性代谢物,在DNS标准库和人类代谢组数据库（HMDB）中进行代谢物的鉴定或推定。将差异性代谢物进行代谢通路分析。结果1、血常规结果显示辐照后白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞的总数有所下降且与未照射的对照组相比有显著性差异,但其值均在正常参考值范围内;血液K+水平以及ATP水平在辐照前后没有明显差异;CCK-8测量PBMC活性和增殖结果可见辐照后PBMC的增殖抑制率大于50%,与对照组相比明显受到抑制;流式细胞术检测PBMC凋亡结果表明,对照组的细胞凋亡小于10%,辐照后PBMC的凋亡率为13.31%,两者有统计学差异（p0.05）。2、利用CIL LC-MS在血浆、红细胞和PBMC中分别可检测到2437个、2508个和2493个代谢物峰对,其中分别有1654个（67.87%）、1730个（68.98%）、1666个（66.83%）代谢物峰对可在标准库和/或HMDB库中被鉴定,辐照前后的代谢物峰对在OPLS-DA中都有良好的区分趋势。利用火山图和维恩图分析差异性代谢物后,血浆、红细胞、PBMC中分别有12、55和44个差异性代谢物峰对能在数据库中被鉴定。代谢通路分析结果显示,血浆中受辐照影响最大的是牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径,亚牛磺酸含量升高;红细胞中受辐照影响较大的是嘌呤代谢;PBMC中受辐照影响较大的是色氨酸代谢和嘌呤代谢途径。PBMC与红细胞的嘌呤代谢途径在辐照后均出现显著性差异,PBMC中与嘌呤代谢途径相关的差异性代谢物的变化情况如下:脱氧鸟苷二磷酸、腺嘌呤含量下降,次黄嘌呤同分异构体、肌苷含量上升;红细胞中与嘌呤代谢途径相关的差异性代谢物变化情况如下:5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核苷酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺、磷酰甲酰胺、次黄嘌呤核苷酸、单磷酸腺苷（AMP）、次黄嘌呤、肌苷的含量均下降。结论辐照前后血液的K+含量和ATP水平没有差异性改变,说明辐照对于血液质量的影响不大。辐照可使白细胞总数及淋巴细胞数量有所下降,但保持在正常参考值范围内。辐照使PBMC增殖抑制、凋亡增加,说明即使细胞在体内存活,也无法发生严重的免疫反应而导致TA-GVHD的发生。利用CIL LC-MS可高效地检测出全血辐照前后血浆、PBMC和红细胞的代谢产物变化,并分析代谢途径差异。血浆在辐照后牛磺酸和亚牛磺酸代谢改变,亚牛磺酸含量升高,其他成分未见明显改变;红细胞和PBMC辐照后嘌呤代谢都发生了改变,红细胞中与嘌呤代谢相关的AMP含量下降,可能会干扰红细胞在辐照后的保存;PBMC中腺嘌呤的含量改变可能会阻碍PBMC的DNA合成,从而抑制PBMC的增殖。本论文从代谢组学的角度说明血液辐照的确能起到预防TA-GVHD的效果,在辐照后为了保证血液质量,也可考虑添加AMP用于保存红细胞。输注辐照血可以更好地预防TA-GVHD,在临床中应提高对于辐照血的认识及推广。