ALOX15B调控热应激条件下仔猪睾丸支持细胞凋亡的分子机制
作者单位：西南大学
学位级别：硕士
导师姓名：王鲜忠
授予年度：2022年
摘 要：脂质稳态是保证细胞正常生理活动的前提。当脂质的氧化还原反应失衡时,脂氧合酶（Lipoxygenase,LOX）会对花生四烯酸等多不饱和脂肪酸进行双加氧反应形成大量的脂质氢过氧化物。脂质氢过氧化物是细胞中主要的脂质过氧化物,在细胞凋亡过程中发挥了重要作用。睾丸支持细胞（Sertoli cells,SCs）为精子发生提供了结构支持和营养供能,其数量决定了成年哺乳动物精子的数量和睾丸的大小。前期研究发现,热应激使SCs产生大量脂质过氧化物并导致SCs凋亡。然而,脂质过氧化物在热应激诱导的SCs凋亡中的作用机制尚不清楚。本研究将有助于揭示热应激条件下SCs中脂质代谢的机制,为缓解热应激与抗SCs凋亡提供新见解。本研究以3周龄仔猪为研究对象,分离与培养SCs,44°C处理30 min,诱导热应激。采用靶向代谢组学,通过液相色谱质谱技术（Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）寻找差异性的脂质过氧化物;通过添加特异性抑制剂、转染si RNA改变脂质过氧化物的氧化酶活性,或者添加p38、JNK、p53的抑制剂抑制相关信号通路的活性;进而运用ELISA检测差异性的脂质过氧化物水平,利用Western blotting检测脂质过氧化物氧化酶的蛋白表达水平、p38磷酸化水平、JNK磷酸化水平与p53蛋白水平,并使用流式细胞术检测细胞凋亡率。试验结果如下:（1）热应激条件下,SCs中脂质过氧化物8-羟基二十碳四烯酸（8-hydroxyeicosatetraenoic acid,8-HETE）和15-羟基二十碳四烯酸（15-hydroxyeicosatetraenoic acid,15-HETE）的含量显著增加;产生8-HETE和15-HETE的ALOX15B的m RNA水平在热应激条件下显著上升;与对照组相比,热应激组ALOX15B的m RNA水平提高了76.30%（P0.05）,其蛋白水平升高了203.00%（P0.01）。（2）用ALOX15B抑制剂黄芩素处理SCs,与对照组相比,当浓度为50μM时,细胞活性下降了10.67%（P0.01）,用浓度为100μM、200μM、300μM、500μM和1 m M黄芩素分别处理SCs后,SCs的活性下降了12.30%（P0.01）、11.84%（P0.01）、36.01%（P0.01）、61.33%（P0.01）和60.56%（P0.01）。进一步研究发现,与对照组相比,热应激条件下50μM黄芩素对ALOX15B蛋白水平的抑制率为28.29%（P0.01）;与只进行热应激处理的SCs相比,50μM黄芩素与热应激共同作用下SCs中8-HETE和15-HETE的含量分别降低了33.97%（P0.01）和23.28%（P0.01）。因而,在本研究中选择50μM为适宜浓度。（3）与对照组相比,热应激组的SCs凋亡率提高了475.77%（P0.05）。热应激下外源的黄芩素抑制了SCs的凋亡。与热应激组相比,热应激下外源的黄芩素使SCs凋亡率降低了76.13%（P0.01）。（4）与对照组相比,热应激组的磷酸化p38、磷酸化JNK与p53的蛋白水平分别增加了10.62%（P0.05）、30.13%（P0.05）和28.58%（P0.01）;与热应激组相比,磷酸化p38、磷酸化JNK与p53的蛋白水平在黄芩素和热应激共同作用下降低了43.71%（P0.01）、34.11%（P0.01）与29.08%（P0.01）。（5）与对照组相比,SCs转染ALOX15B的si RNA1、si RNA2与si RNA3后,ALOX15B蛋白水平降低了69.32%（P0.01）、45.08%（P0.01）和59.04%（P0.01）。与热应激组相比,SCs转染ALOX15B的si RNA2、si RNA3后热应激共同处理下,8-HETE的含量分别降低了26.21%（P0.01）与25.77%（P0.01）,15-HETE的含量分别降低了10.93%（P0.01）与40.76%（P0.01）;磷酸化p38的蛋白表达量分别降低了7.32%（P0.01）和58.54%（P0.01）;磷酸化JNK的蛋白表达量分别降低了59.28%（P0.01）和33.46%（P0.01）;p53的蛋白表达量各自减少了22.63%（P0.01）和13.28%（P0.01）。（6）与热应激组相比,热应激条件下p38抑制剂（SB202190）对p38磷酸化水平的抑制率为40.15%（P0.01）;热应激与SB202190共同作用下,p53蛋白水平降低了56.63%（P0.01）,SCs的凋亡率降低了85.45%（P0.01）,ALOX15B
同方学位论文库