亚砷酸钠与高糖通过AMPK-SKP2-CARM1信号通路调控INS-1细胞自噬损伤的作用机制

作     者：迪力娜尔·买买提 

作者单位：新疆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢惠芳

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：亚砷酸钠 高糖 INS-1细胞 AMPK-SKP2-CARM1信号通路 自噬 

摘      要：目的:亚砷酸钠和高糖均是糖尿病的危险因素,在此基础上探讨亚砷酸钠与高糖分别在AMPK-SKP2-CARM1信号通路致INS-1细胞自噬损伤的作用。为阐述砷暴露及高糖毒性与糖尿病发病关联以及分子机制提供研究依据。方法:将对数生长期INS-1细胞随机分为对照组,亚砷酸钠染毒组(终浓度分别为4.00、8.00、16.00μmol/L亚砷酸钠)、高糖组(33.00mmol/L葡萄糖)均培养24h、48h、72h。1.CCK-8法测定细胞存活率;2.倒置显微镜观察细胞形态学改变;3.DCFH-DA探针测定细胞活性氧(ROS)水平。4.Annexin-FITC/PI染色法检测凋亡率5.采用免疫荧光和激光共聚焦技术观察自噬体(LC3Ⅱ)在细胞膜的表达情况6.实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)法测定AMPK-SKP2-CARM1信号通路基因m RNA和自噬及凋亡相关蛋白LC3、Beclin1、Bcl-2基因m RNA的表达水平。7.蛋白免疫印迹法(Western Blot)测定各组INS-1细胞AMPK-SKP2-CARM1信号通路蛋白和自噬及凋亡相关蛋白LC3、Beclin1、Bcl-2的表达水平。结果:1.与对照组相比,随着亚砷酸钠染毒浓度的升高和染毒时间的增长,染砷组INS-1细胞存活率逐渐降低(P0.05);高糖组INS-1细胞存活率随着暴露时间的延长先升高再下降(P0.05)。2.染砷组INS-1细胞形态皱缩,漂浮细胞变多。3.亚砷酸钠及高糖暴露均可诱导INS-1细胞活性氧(ROS)水平升高(P0.05)。4.染砷组INS-1细胞凋亡率随染毒时间和染毒浓度增加而升高(P0.05),高糖组INS-1细胞凋亡率随暴露时间的增加而升高(P0.05)。5.染砷组INS-1细胞自噬囊泡膜上LC3Ⅱ聚集,随着砷染毒浓度和时间的增加荧光信号增强;高糖组INS-1细胞未见明显的LC3Ⅱ荧光信号。6.与对照组相比,砷染毒24h后,随着砷染毒浓度的增加,染砷组INS-1细胞AMPKα、CARM1、LC3、Beclin1、Bcl-2基因m RNA表达水平逐渐升高(P0.05),而染毒24h、72h后随着砷染毒浓度的增加而下降(P0.05);SKP2、PGC-1α基因m RNA表达水平依次降低(P0.05);染砷组INS-1细胞AMPKα1、SKP2、PGC-1α、Beclin1、Bcl-2蛋白表达量随染毒时间和染毒浓度的增加而下降(P0.05);LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、CARM1的蛋白表达水平依次升高(P0.05)。7.随高糖暴露时间的增加,高糖组AMPKα、CARM1、PGC-1α、LC3、Bcl-2基因m RNA及蛋白逐渐下降;SKP2、Beclin1基因m RNA及蛋白表达水平逐渐升高(P0.05)。结论:1.亚砷酸钠和较长时间的高糖暴露均可抑制INS-1细胞的活性、诱导细胞内ROS水平升高、导致细胞凋亡。2.亚砷酸钠和高糖暴露通过调控AMPKSKP2-CARM1信号通路导致INS-1细胞自噬水平改变可能是INS-1细胞损伤的重要机制之一。