乳腺癌驱动基因的筛选及丹参酮ⅡA对驱动基因影响的初步探索

作     者：王圆 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陆茵

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：丹参酮ⅡA 乳腺癌 休眠肿瘤 预防效应 驱动基因 

摘      要：[研究背景与目的]世界卫生组织国际癌症研究机构最新发布的癌症数据显示,乳腺癌已经超过肺癌成为全球发病率最高的癌症类型。虽然乳腺癌诊治方面已经不断的改进和完善,从早期的化学疗法发展到靶向疗法和免疫疗法,但是与以往在常规化学疗法中观察到的结果相似,癌细胞对于靶向疗法和免疫疗法仍然会产生耐药问题。肿瘤的发生发展是一个受多因素作用,由多基因参与的复杂生物现象。肿瘤耐药和难以彻底治愈的根本原因在于肿瘤的发展过程中,基因组的不稳定性会产生一系列体细胞突变,从而导致肿瘤异质性的发生,在给定的微环境背景下特定突变被选择,导致肿瘤进化。这些赋予肿瘤细胞生长优势和生存能力的突变被称为驱动突变,影响了肿瘤的发生发展和进化方向,是致瘤的关键,驱动突变所在的基因为驱动基因。由此可见,鉴定肿瘤相关的驱动基因,对于了解肿瘤发生的机制与肿瘤的预防和治疗有重大意义。基于此,我们使用自发性乳腺癌小鼠模型MMTV-PyMT,该模型小鼠能够自发性的形成乳腺增生、腺瘤、早期癌和晚期癌阶段,通过全外显子测序筛选各个阶段的候选驱动基因,并初步探讨丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA,TanⅡA）对乳腺癌候选驱动基因的影响。[研究方法与结果]本课题第一部分实验研究首先使用自发性乳腺癌小鼠模型MMTV-PyMT,通过灌胃给予不同剂量（30mg·kg-1和60mg·kg-1）的丹参酮ⅡA,证实了 60mg·kg-1丹参酮ⅡA可以显著抑制乳腺由腺瘤向早期癌的恶变;其次利用静息态乳腺癌细胞模型MDA-MB-436,丹参酮ⅡA给药处理24小时后,EdU增殖实验证实了丹参酮ⅡA体外可以抑制MDA-MB-436细胞的增殖能力;此外,我们使用Q-TRAP 4500型液相色谱-串联质谱联用仪检测了给药30分钟、1小时和2小时后的MMTV-PyMT小鼠乳腺组织和血浆中丹参酮ⅡA及其代谢产物丹参酮ⅡB和紫丹参甲素A的含量,结果表明乳腺组织中丹参酮ⅡA及其代谢产物的浓度低于血浆中含量,且在1小时左右浓度达到峰值,说明丹参酮ⅡA多数通过消化道吸收入血后,进入血液循环发挥药效,到达靶器官的药物较少。本课题第二部分收获了 MMTV-PyMT小鼠乳腺增生、腺瘤、早期癌和晚期癌阶段的组织,其中腺瘤阶段的病变区域使用激光捕获显微切割（Laser capture microdissection,LCM）进行收集。Illumina HiSeq PE150全外显子测序,测序数据过滤后对变异信息进行挖掘。根据测序结果筛选出各个阶段的单核苷酸突变、拷贝数变异和插入缺失突变;基于拷贝数增加、单核苷酸突变（stopgain和frameshift）筛选出不同阶段的候选驱动基因,使用一代Sanger测序和qPCR对候选驱动基因进行验证,初步筛选出mid1和pitx1两个驱动乳腺由腺瘤恶变为早期癌阶段的关键基因。最后通过qPCR检测第一部分乳腺组织中候选驱动基因的表达,发现丹参酮ⅡA可以影响pitx1的表达。[结论与意义]基于以上一系列结论,我们发现丹参酮ⅡA体外可以显著抑制人源乳腺癌休眠细胞MDA-MB-436的增殖,体内可以延缓MMTV-PyMT小鼠乳腺腺瘤向早期癌的恶变。通过对乳腺癌发生发展不同阶段的组织进行外显子测序,筛选出候选驱动基因。我们重点考察了腺瘤恶变为早期癌这一阶段的候选驱动基因,初步验证出两个候选驱动基因mid1和pitx1,并且我们发现60mg·kg-1的丹参酮ⅡA可以影响候选驱动基因pitx1的mRNA水平。该课题初步筛选出乳腺癌发生发展不同阶段的候选驱动基因,并且从基因组层面出发,以驱动基因为切入点,为中药新药开发和临床用药“治未病提供新的思路。