H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗安全与免疫效力评价及配套检测方法的单克隆抗体制备

作     者：冯娟 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：彭大新

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：H7N9亚型禽流感 安全性评价 DIVA疫苗 单克隆抗体 

摘      要：2013～2016间,H7N9亚型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）对禽呈现低致病性,但在2016年底之后,H7N9亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）逐渐流行并成为优势流行株。相比于低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV）,H7N9 亚型 HPAIV 不仅致病力强,而且与LPAIV的遗传距离不断扩大,抗原差异增加,使得AIV防控变得更加困难。净化是控制该疫病的有效手段,已列入我国政府制定的《国家中长期动物疫病防治规划》,但由于疫苗的使用,使得在诊断过程中难以区别自然感染和疫苗免疫动物,因此迫切需要研制可用于区别自然感染和疫苗免疫动物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA）的标记疫苗实现H7N9亚型AIV的净化。实验室前期研制出H7N9亚型 AIV 灭活标记疫苗候选株 A/Chicken/Huadong/JD-cHA/17（JD-cHA/17）,并制备了针对该多肽的单克隆抗体,建立竞争抑制ELISA方法。由于H7N9亚型AIV的不断变异,所研制的DIVA疫苗及配套检测方法对新出现的变异株的免疫保护效果和检测能力未知。因此,需要对上述疫苗进一步开展安全性和系统性的免疫效力评价;同时评价配套检测方法的广谱性,为H7N9亚型禽流感的防控和净化提供有效工具。1.JD-cHA/17标记疫苗候选株生物学特性及疫苗安全性评价为了评价JD-cHA/17疫苗候选株的遗传稳定性和安全性,本研究对其进行生物学特性和疫苗免疫安全性评价。在鸡胚中传代5次后,JD-cHA/17具有较高的HA效价和EID50滴度,分别达10 log2和109.03/ml,与母本株无差异。第5代的JD-cHA/17的HA基因及标记基因和第1代的序列没有突变。热稳定性试验和pH稳定性试验结果显示,在37℃条件下与母本株JD/17相比,JD-cHA/17的HA效价保持不变;42℃条件下,JD-cHA/17的HA效价仅第1天下降了 llog2;在56℃作用90 min后,JD-cHA/17的HA效价降为0,因此和母本毒株一样属于热不稳定型病毒;在pH稳定性试验中,除了在pH 5.0环境中下降了 llog2,其余pH 3.0、pH 7.2和pH 9.0环境中JD-cHA/17的HA效价保持不变,显示了良好的pH稳定性。用白油作为佐剂制备JD-cHA/17灭活疫苗,对SPF鸡进行超剂量注射和重复注射,结果显示,免疫鸡食欲、精神状态均正常,体重增长情况与对照组一致,表明疫苗候选株JD-cHA/17稳定性好、安全性高。2.JD-cHA/17灭活标记疫苗免疫效力和DIVA特性评价为了进一步明确JD-cHA/17灭活疫苗免疫效力,设置了不同的剂量组免疫SPF鸡,结果显示,免疫后21天3个不同剂量组针对母本株的HI效价为5.8±1.62 log2、6.5±1.05 log2、7.4±0.52 log2,HI效价呈现剂量依赖性。JD/17（母本株）和A/Chicken/China/liaoning/0866/2020（LN08866,Re3 like）攻毒试验结果显示,JD-cHA/17免疫组均未出现明显的临床症状和鸡只死亡,对两种攻毒株均能提供100%的临床保护。在JD/17攻毒后5天,JD-cHA/17免疫组的排毒保护率为90%,而PBS对照组排毒保护率仅为10%;在LN0866攻毒后5天,JD-cHA/17免疫组的排毒保护率为80%,PBS对照组全部死亡,表明该疫苗对母本株和流行株均有较好的保护性。用实验室前期基于3G10单抗建立的竞争抑制ELISA方法评价JD-cHA/17的DIVA特性,结果显示,针对JD-cHA/17免疫血清的抑制率为9.70±2.42%,低于阴性值,针对JD-cHA/17免疫后LN08866、JD/17攻毒血清的抑制率分别为48.08±6.82%和33.27±7.99%,显著高于阴性值,能够起到DIVA作用。但针对LN08866单独免疫血清的抑制率仅为11.1±0.56%,表明基于3G10单抗建立的竞争抑制ELISA方法仅能区分JD-cHA/17免疫血清和H7 JD/17感染血清,对于LN08866免疫或感染血清难以有效识别,有必要更新所配套的竞争抑制ELISA方法。3.基于H7N9亚型Re3 like毒株的HA2特异性表位12肽的单克隆抗体制备为了解决基于3G10单抗的竞争抑制ELISA方法的广谱性问题,本研究针对H7N9亚型Re3 like病毒LN08866 HA2特异性表位合成12肽,并利用牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）进行偶联,将该偶联物作为免疫原对小鼠进行免疫,利用单克隆抗体技术成功制备了 6株针对H7 Re3 like LN08866毒株HA2特异性表位12肽的单克隆抗体4E5、6C2、6F4、6F5、6G4、6G6,并制备了单抗腹水。6株单抗腹水的效价从5.12×104～8.19×105不等。亚类测定显示4E5、6F4、6F5和6G4为IgG1亚类,6C2和6G6 为 IgM 亚类。间接免疫荧光分析试验（IndirectImmunofluorescenceassay,IFA）结果显示,其中3株4E5、6F5、6G4具有荧光特性,能与H7N9亚型AIVRel like、Re2 like、Re3 like三个分支反应,而不与疫苗候选株JD-cHA/17和H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型AIV反应,表明上述单抗特异性良好,同时具有区分JD-cHA/17疫苗候选株和其他H7N9野毒的能力,为建立检测广谱性H7N9亚型AIV感染血清抗体奠定了基础。