SESTRIN1通过SIRT1影响肝脏的胰岛素抵抗

作     者：杨佳卉 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姚红

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题：SIRT1 SESTRIN1 慢性炎症 肝脏氧化应激 

摘      要：目的:肝脏作为一个代谢旺盛的器官,极易遭受到氧化的攻击,从而造成肝损伤。应激诱导蛋白1(Sestrin1,SESN1)是一种氧化应激的关键抑制因子,并在各种伤害性刺激对细胞具有一定的保护作用,但是SESN1对于肝脏的保护机制尚不明确。沉默信息调节蛋白1(Sirtuin 1,SIRT1)可通过降低肝脏、骨骼肌和脂肪组织中的活性氧水平,进而改善细胞的存活。本研究拟通过体外试验和体内实验探寻SESN1是否参与改善肝脏炎症和胰岛素抵抗的发生,以及SIRT1是否在SESN1通路中发挥作用。方法:1.体外实验a.取野生型(Wild Type,WT)C57BL/6J雄性小鼠的肝原代细胞,分为两组,对照组滴加对照病毒,实验组滴加SESN1腺病毒,培养48h后收取细胞,提取RNA,逆转录并做RT-q PCR检测肝细胞中SIRT1、SESN1、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase 2,SOD2)、线粒体生物合成基因(Cytochrome C,CYT c)、过氧化物酶体增殖物活化受体α(Peroxisome Proliferators-Activated Receptorsα,PPARα)、丙酮酸脱氢酶激酶4(Pyruvic Dehydrogenase Kinase 4,PDK 4)、谷胱甘肽过氧化物酶1(Glutathione peroxidase 1,GPX 1)、以及促炎因子肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNFα)与白介素-6(Interleukin-6,IL-6)m RNA的表达水平;接着使用Mito SOX Red(分子探针)测定肝原代细胞内的线粒体活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)产生水平;使用通用基因组DNA提取试剂盒从细胞中分离总DNA,做RT-q PCR检测COXII用于反映线粒体脱氧核糖核酸(mitochondrial DNA,mt DNA)的含量。b.取肝脏特异性敲除SIRT1(Liver Specific SIRT1-deficient,SIRT1-LKO)雄性小鼠的肝原代细胞,分为两组,对照组滴加对照病毒,实验组滴加SESN1腺病毒,重复方法a中操作。2.体内实验a.在高脂喂养下的WT雄性小鼠和SIRT1-LKO小鼠各六只,每周固定时间记录小鼠的体质量,在高脂喂养两个月后,进行胰岛素耐量实验。b.取雄性WT小鼠12只喂食正常饮食,均分为对照组与实验组。取雄性WT小鼠12只喂食高脂饮食,均分为对照组与实验组。取SIRT1-LKO雄性小鼠12只喂食正常饮食,均分为对照组与实验组。取SIRT1-LKO雄性小鼠12只喂食高脂饮食,均分为对照组与实验组。将所有小鼠饲养并保持在12小时光暗周期和常规无限制饮食中。正常饮食与高脂肪饮食喂养8周后,给实验组进行病毒注射,在实验小鼠进行尾静脉注射,注射病毒滴度单位是1×10空斑形成单位(Plaque Forming Unit,PFU)的SESN1腺病毒。小鼠尾静脉给予腺病毒后7天后,实验操作人员开始对对照组以及实验组的小鼠进行胰岛素耐量试验(Insulin Tolerance Test,ITT)的测定。所有动物实验的实施与执行均经过中国医学科学院实验动物研究所动物研究委员会与北京协和医学院的审批及应准(***-A01-2013-029),并且严格按照动物实验的机构伦理指南进行实验操作。结果:1.过表达SESN1改善肝细胞氧化应激用SESN1腺病毒感染原代肝细胞时,SESN1的m RNA水平明显增加。SESN1过表达使WT小鼠肝原代细胞中线粒体生物合成基因CYT C、SOD2和GPX1的m RNA表达水平明显增加,除此以外,SESN1在WT肝细胞中的过度表达也促进了线粒体脱氧核糖核酸的含量,并抑制了ROS的产生。2.过表达SESN1增加肝原代细胞的脂肪酸氧化用SESN1腺病毒感染原代肝细胞时,PDK4和PPAR-α在WT小鼠原代肝细胞中的m RNA表达水平上调。3.过表达SESN1改善肝细胞慢性炎症用腺病毒SESN1感染WT小鼠的肝原代细胞,通过RT-q PCR发现炎症因子IL-6和TNFα的m RNA水平明显下降。4.过表达SESN1改善胰岛素敏感性通过检测喂食正常标准饲料和高脂饮食用SESN1腺病毒感染的WT小鼠的ITT发现,过表达SESN1组比对照组胰岛素敏感性增强。5.过表达SESN1促进SIRT1表达用腺病毒SESN1感染WT小鼠的肝原代细胞,通过RT-q PCR发现SIRT1的m RNA水平明显增加。***1-LKO小鼠改善胰岛素敏感性并减轻体质量与对照组WT小鼠相比,SIRT1-LKO小鼠表现为体质量明显减轻(P0.05)。另外,SIRT1-LKO小鼠胰岛素敏感性明显改善。***